[发明专利]具有与γ磷酸结合的电活性标记的核苷三磷酸

说明书

在先申请

本申请要求于2007年9月27日提交的美国临时专利申请60/960,388的优先权。

技术领域

本发明涉及一种适用于监测与磷酸化相关的事件的新的电活性核苷三磷酸(nucleotide tiphosphate)。

背景技术

在细胞通信网络中，许多酶和受体在“开(或上去，on”)和“关(或下来，off”)之间转换，或换句话说，是“磷酸化的”和“去磷酸化的”。在磷酸化期间，来自ATP的磷酰基转移至蛋白质特定的丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基。由于这些修饰，蛋白质的功能或定位可以变化，这在一些情况下可以导致肿瘤蛋白的形成¹。

异常蛋白质磷酸化是许多疾病，包括癌症、糖尿病和慢性炎性疾病的原因。量化蛋白质激酶活性的分析方法对于理解其在这些疾病的诊断和疗法中的作用是很关键的。目前对于检测蛋白质磷酸化的方法依赖于放射标记的ATP³、基于荧光的方法⁴、和荧光共振能传递(FRET)⁵。近来，结合生物素的ATP分子被开发用于检测磷酸化反应⁶。然而，需要用电活性或光学标记对肽进行其它修饰，这增加了成本并导致了处理过程冗长和耗时。

因此，需要开发一种监测或检测与磷酸化相关的事件的可替换方法，其能够克服当前检测方法的至少一种缺点。

发明内容

现在已经开发了一种新的电活性核苷三磷酸，其适用于监测和/或检测与磷酸化相关的事件，包括磷酸化本身的可替换方法中。

因此，本发明一方面，提供了含有电活性标记的γ磷酸基团的核苷三磷酸结合物(conjugate)。

本发明另一方面，提供了一种检测激酶底物磷酸化的方法，包括：

(a)在电极表面固定底物；

(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用激酶和含电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；

(c)检测底物的磷酸化。

一方面，磷酸化通过电化学方法检测。另一方面通过光谱法，包括质谱法检测磷酸化。

本发明另一方面，提供了一种检测样品中感兴趣的激酶的方法，包括：

(a)在电极表面上固定对感兴趣的激酶特异的底物；

(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用样品和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；和

(c)检测底物的磷酸化，

其中底物的磷酸化指示样品中激酶的存在。

本发明另一方面，提供了识别候选激酶底物的方法，包括：

(a)在电极表面上固定候选激酶底物；

(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用含激酶的电解液和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；和

(c)检测底物的磷酸化，其中候选底物的磷酸化指示所述候选物质是激酶的底物。

本发明另一方面，提供了一种筛选调节激酶活性的候选化合物的方法，包括：

(a)在电极表面上固定激酶底物；

(b)在允许检测磷酸化活性的条件下，用激酶、候选化合物和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸结合物孵育固定的底物；和

(c)检测底物的磷酸化水平，其中，在缺乏所述化合物时，磷酸化水平从一个磷酸化水平实现变化指示所述化合物调节所述激酶的活性。

本发明另一方面，提供了一种高通量筛选样品中存在蛋白激酶的方法，包括：

(a)提供一种包含多个电极的微电极阵列；

(b)将激酶底物固定于阵列中的每一电极上；

(c)用感兴趣的样品和含有电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸孵育携带所述用感兴趣的样品固定的底物的所述微电极阵列；和

(d)检测每一电极中底物的磷酸化水平，其中在多个电极中的一种或多种底物的磷酸化指示在样品中存在对一种或多种磷酸化底物特异的激酶。

本发明另一方面，提供了一种诊断对象中与蛋白激酶的水平异常或缺乏相关的疾病的方法，包括：

(a)将与疾病相关的激酶的底物固定于一个或多个电极上；

(b)用来自对象的样品和含电活性标记的γ磷酸的核苷三磷酸孵育携带固定底物的一个或多个电极；

(c)检测每一阵列的电极中底物的磷酸化水平，其中相对于正常对照，在对象样品中的异常磷酸化水平或缺乏磷酸化指示所述对象患有或易于患上所述疾病。