[发明专利]由法医样品回收精子核酸的方法

说明书

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2007年7月23日申请的美国临时申请号60/961,734的优先权。

发明领域

本发明涉及由含有细胞和非细胞杂质的样品中分离细胞并进一步由具体的细胞类型分离核酸的领域。

更具体地说，本发明涉及以下领域：由样品分离精细胞，所述样品包含胞外杂质和至少一种其它类型的污染细胞(例如上皮细胞)，并由精细胞和非精细胞回收DNA，用于各种目的，包括法医目的。

发明背景

性攻击证据的法医DNA分析经常包括分析精细胞的DNA和诸如上皮细胞的其它细胞的DNA。精细胞一般通过用拭子擦拭粘膜从强奸受害者获得。得自受害者的样品经常包含精子和上皮细胞的混合物。因为上皮细胞可能比样品中的精细胞数目多出至少一个数量级，所以前者可以在纯化精子DNA时引起精细胞DNA污染。因此，经常需要在分析前尽可能干净地分离精细胞和上皮细胞，或精子DNA和上皮细胞DNA。精子和上皮细胞的DNA的分开和分离在由法医标本鉴别攻击者和将攻击者与受害者关联时是必需的步骤。

用于由拭子纯化精子的标准方法基于差异提取。精子DNA与受害者DNA的分离去除了不定性，有利于DNA分析，并使得可以更容易地判读出强奸案例中攻击者的DNA谱。尽管差异提取常用于分离精子和上皮细胞，但标准方案是耗时耗力的，在精细胞裂解前需要上皮细胞裂解。

通常，首先重悬浮法医标本中的细胞，之后用含有蛋白酶K和SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液选择性消化受害者的上皮细胞。通过离心将完整精子与溶解的污染DNA和上皮细胞碎片分离，小心除去上清液，彻底洗涤精子沉淀(参见例如Giusti等人，J.Forensic Sci，31：409-417，1986；Gill等人，Nature 318：577-579，1985；Wiegand等人，Int J.Legal Med.，104：359-360，1992；和Yoshida等人，Forensic Sci.Int.，72：25-33，1995)。遗憾的是，离心和小心除去上清液的过程难以自动化，并可能由于多个样品操作步骤而引起精子DNA的损失。

在该程序的一个实例中，Gill等人(出处同上)描述了一种由取自性攻击受害者的阴道拭子分离精子DNA的方法。这些拭子包含精子，也包含极大过量的受害者上皮细胞。通过优先裂解(即通过温育在含有SDS和蛋白酶K的缓冲溶液中的细胞混合物)除去上皮细胞和包含在这些细胞中的DNA。精子核不受该处理的影响，因为它们具有二硫键交联的富巯基蛋白，而其它细胞类型被消化，相应的DNA被溶解。在优先裂解后，离心样品，以分离精子核和受害者的溶解的DNA。除去含有受害者DNA的上清液，并重复洗涤精子沉淀。随后通过用含有SDS、蛋白酶K和DTT(二硫苏糖醇)的缓冲溶液处理裂解精子核，并通过离心将裂解物与污染细胞分离。

对于具有低精子计数的样品，Wiegand等人(出处同上)使用温和裂解条件并取消洗涤步骤尝试改善Gill等人的方法。

许多用于分离精细胞和上皮细胞的建议方法基于过滤。Chen等人(J Forensic Science 43：114-118，1998)和Garvin(PCT/US01/01835)在差异裂解前通过重力或温和真空过滤或通过使用可以承受强真空或离心力而孔的大小没有增加的滤器材料分离精子和上皮细胞。然后将DNA和在滤过液中收集的精子分离。

差异提取，尤其对精细胞分析而言，如下进行：首先裂解上皮细胞，然后由精子提取DNA。为了减少法医分析的时间，最初需要选择性提取精细胞的DNA。另外，因为选择性上皮细胞裂解条件还引起某些精子裂解，所以在精细胞分离之前裂解上皮细胞减少了样品中存在的精细胞数。需要除去上皮细胞DNA的额外洗涤步骤也促成精细胞的损失。

上皮细胞或其它污染细胞类型(如白细胞)的裂解或存在可能妨碍精确的精子分析。在法医样品中存在的来自受损的非精细胞的DNA可以污染细胞(最有可能通过结合精细胞表面)，其可能限制犯罪者的精确鉴定，尤其是在回收的精细胞数低时。

本发明人发现，尽管存在由异质细胞群中(由各个细胞类型中)差异提取一种核酸类型的技术，但残留的污染核酸仍是保证更精确的提取方法的问题。其中对高度特异性的差异提取存在需要的一种应用是法医，具体地说是性攻击分析。