[发明专利]拷贝数变化确定、方法和系统

说明书

对相关申请的交叉参考

本申请按照35U.S.C.§119(e)，要求2007年9月7日提交的美国临时 专利申请号60/967,897的权利，通过参考将其全部公开内容引入本文。

发明领域

本发明涉及用于确定来自小群体或个体基因组内拷贝数变化的方法并 发现在生物学和医学中的应用。

发明背景

“数字PCR”指这样的方法，其中在PCR扩增一种以上靶序列之前， 将样品中存在的单个核酸分子分配到许多单独的反应体积(例如，室或等 分试样)中。调节样品中单个分子的浓度，以使得在分配后，每个反应体 积包含少于一个离散的多核苷酸分子(或连接的多核苷酸分子的集合)， 且大部分室包含0或一个分子。靶序列的扩增导致二进制数字输出，其中 每个室被确定为包含或不包含表示相应靶序列存在的PCR产物。包含可 检测的PCR终产物水平的反应体积的计数是绝对核酸量的直接测量。在 一种数字PCR版本中，多核苷酸分子通过分隔它们而被分配到单独的反 应体积中。一种分隔方法使用BioMark^TM 12.765数字阵列(Fluidigm Corp.， South San Franscisco，CA)。该芯片利用将样品混合物和试剂分隔到765个 纳升体积反应室中的集成电路通道和电子管。将每个混合物中的DNA分 子随机分隔到每组的765个室中。然后热循环该芯片，并在Fluidigm′s BioMark实时PCR系统上成像，且最初包含1个以上分子的阳性室可以通 过数字阵列分析软件来计数。关于数字PCR的讨论，参见，例如，Vogelstein 和Kinzler，1999，Proc Natl Acad Sci USA (美国国家科学院学报)96：9236-41； McBride等，美国专利申请公开号20050252773，特别是实施例5；

拷贝数变化(CNVs)是基因组区域的获得或缺失，其尺寸在500个碱 基以上的范围内(通常在5千和5百万碱基之间)。全基因组研究已经揭 示了大量CNV区域在人中的存在和遗传多样性在一般人群中广阔范围。 CNV由于其在人遗传病症中的作用，一直是许多近期研究的焦点。参见， 例如Iafrate等，2004，Detection of large-scale variation in the human genome (检测人基因组中的大规模变化).Nat Genet(自然遗传学)36：949-951； Sebat等，2004，Large-scale copy number polymorphism in the human genome (人基因组中的大规模拷贝数多形性).Science(科学)305：525-528；Redon 等，2006，Global variation in copy number in the human genome(人基因组中 拷贝数的综合变化).Nature(自然)444：444-454；Wong等，2007，A comprehensive analysis of common copy-number variations in the human genome(人基因组中常见拷贝数变化的综合分析).Am J Hum Genet(美 国人类遗传学杂志)80：91-104；Ropers，2007，New perspectives for the elucidation of genetic disorders(阐明遗传病症的新观点).Am JHum Genet (美国人类遗传学杂志)81：199-207；Lupski，2007，Genomic rearrangements and sporadic disease(基因组重排和偶发性疾病).Nat Genet (自然遗传学)39：S43-S47，通过参考将其每篇引入。非整倍性，诸如三 体性或全染色体缺失，是与许多人类疾病有关的局限型拷贝数变化。

发明简述

本发明涉及用于确定来自小群体或个体的基因组中拷贝数变化的方 法。所述方法在通过数字PCR分析之前，提供目的基因在样品中的预扩 增。预扩增步骤容许将基因的各个拷贝的分布分配到各个PCR反应样品 中，从而以这样的方式检测，所述方式是比在无预扩增条件下由数字PCR 确定时更能代表实际的拷贝数。