[发明专利]提高糖蛋白唾液酸化作用的组合物与方法

说明书

发明领域

本发明一般涉及唾液酸酶。特别地，本发明涉及提高糖蛋白唾液酸化作用的组合物与方法。

发明背景

采用DNA重组技术培养哺乳动物细胞而生产的糖蛋白，代表了人类保健治疗药品中的一个重要的种类。糖蛋白的生物学功能往往高度依赖于其碳水化合物结构。在糖蛋白中发现的众多糖中，末端唾液酸被认为是特别重要的。已发现，唾液酸影响各种糖蛋白的溶解度、热稳定性、抗蛋白酶的攻击、抗原性以及比活性。糖蛋白中唾液酸的量是两个相反过程的结果，即通过唾液酸转移酶活性胞内增加唾液酸以及通过唾液酸酶切割胞外去除唾液酸。

当从血清糖蛋白除去末端唾液酸时，与唾液酸化的对应物(counterpart)相比，去唾液酸化的蛋白具有显著降低的循环半衰期。其他糖蛋白中唾液酸的去除与降低的生物活性和增加的血清清除率有关。此外，在分批培养的细胞生产糖蛋白的过程中，营养物质的消耗和产物的积累可能会改变细胞环境，使得蛋白质糖基化随着时间变化而降低。再者，由此产生的糖蛋白往往有糖形异质性，并且，生产过程中有显著的批次变化。这些变化在用于蛋白质治疗药物大规模生产的生物加工过程中是不可接受的。因此，在哺乳动物细胞培养系统中，我们往往需要使糖蛋白产物中最终唾液酸含量最大化，以确保其作为有效药物的质量和一致性。因此，存在对具有增强的糖蛋白唾液酸化作用的哺乳动物细胞培养系统的需求。这一系统将提高充分唾液酸化的重组糖蛋白的生产。

发明概述

在本发明的各个方面中，提供了一种细胞系，该细胞系包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达。表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)与SEQ IDNO：2至少约95％同一的序列，和(b)与SEQ ID NO：4至少约80％同一的序列。

本发明的另一个方面包括一种生产糖蛋白的方法。该方法包括在细胞中表达编码糖蛋白的核酸序列，所述细胞包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达，其中糖蛋白相对于适当对照，具有增强的唾液酸化作用。在细胞中表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组：(a)与SEQ ID NO：2至少约95％同一的序列，和(b)与SEQ ID NO：4至少约80％同一的序列。

本发明的另一个方面提供了一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO：2组成的多肽。

本发明的另一个方面还包括一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO：4组成的多肽。

本发明的另一个可选方面提供了一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：2组成。

本发明的另一个方面包括一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQID NO：4组成。

本发明的其他方面和特征在下面更为详细地描述。

彩色附图的引用

本申请文件包含至少一副彩色照片。具有彩色照片的这一专利申请公布文本的拷贝在经过请求和偿付必要的费用后由专利局提供。

附图说明

图1示出由CHO Neu1、Neu2和Neu3基因编码的蛋白质的唾液酸酶活性。所呈现的是，使用含有所示各种基因的编码区的表达构建体(或任何空表达构建体)转染的细胞溶胞产物中的酶活性。

图2示出由CHO Neu1、Neu2和Neu3基因编码的蛋白质的唾液酸酶活性的抑制。所呈现的是，在不存在或存在两种浓度的两种不同的唾液酸酶抑制剂的情况下，在用含有各种基因编码区的表达构建体转染的细胞的溶胞产物中所测量的酶活性。

图3示出Neu1、Neu2和Neu3蛋白质的亚细胞位置。所呈现的是共焦荧光显微图像，其中带FLAG标签的Neu蛋白质以绿色显示，溶酶体(Lys)标志物以红色显示，而质膜(PM)标志物以蓝色显示。

图4示出采用小干扰RNA(siRNA)技术对Neu1、Neu2和Neu3mRNA表达的敲低。所呈现的是，在使用基因特异性siRNA(S1-S5)或者靶向不相关GFP核酸序列的对照siRNA(C)敲低各种基因后，采用基因特异性引物通过RT-PCR扩增的产物。对照基因(β-2微球蛋白(microglubulin)，β2M)的表达不受siRNA影响。

图5示出采用小干扰RNA(siRNA)技术对(A)Neu1、(B)Neu2和(C)Neu3

mRNA的敲低表达。所呈现的是Q-RT PCR结果，其显示当使用对每种Neu基因特异的siRNA或者靶向不相关核酸序列(GFP)的对照siRNA时，各种基因的相对表达。