[发明专利]通过环状变换得到的新的蛋白变异体

说明书

本发明涉及通过环状变换(circular permutation)回收新的蛋白变异体的方法，并涉及通过该方法回收的新的蛋白变异体。

为了优化已知的洗涤剂酶的性质，通常使用的突变方法中，以定向方式或随机产生突变，或通过插入或缺失来导入或移除氨基酸。

常规突变方法的替代方案以所谓的环状变换方法为代表。在现有技术中，环状变换方法从原理上已经描述了一段时间了。例如，Graf和Schachmann(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，11591-11596)，提供了已经用来进行过环状变换方法的酶和其他蛋白的概述。

在环状变换方法中，通过遗传工程对突变的蛋白的N-和C-末端进行了重新定义。基本的假设是，只有在其中N-和C-末端位置彼此接近的蛋白中才能进行环状变换方法，以便环状变换产生的蛋白的总体结构基本上未改变。

到目前为止，已经用来进行过交替变换方法的已知酶和蛋白的另一个共同特点是，蛋白直接表达为活性形式。但是，也存在一些类型的蛋白，特别是酶，表达为无活性形式的前蛋白(preprotein)、蛋白原(proprotein)或前蛋白原(preproprotein)，并只有在表达后通过酶解才转变成活性形式。蛋白的“前(pre)”部分是信号肽，负责引导表达的蛋白进入正确的目标细胞区室，而蛋白的“原(pro)”部分将蛋白保持在无活性状态，直到在适合的位置和时间，通过在靶位置处活化，它才转换成活性形式。

迄今为止，已经假定只有对一方面具有位置彼此接近的N-和C-末端，另一方面被天然表达为成熟的氨基酸序列、即没有前肽、肽原或前肽原的蛋白，才能成功地执行环状变换方法，因为对于成熟蛋白来说，前肽、肽原或前肽原的定位被认为是正确加工和折叠所必需的。

现在，已经意外并出乎所有预期地发现，即使在天然表达为前蛋白、蛋白原和/或前蛋白原的那些蛋白以及特别是酶的情况下，如果在成熟蛋白的DNA上执行环状变换方法，并且如果将相应的信号肽、肽原和/或前肽原的DNA附加在通过交替变换获得的DNA上，那么也可以在环状变换方法的帮助下获得新的蛋白变异体。

这是出人意料的，因为一方面没有预料到人工构建物可以成功地被信号肽引导到意向的靶细胞区室中，另一方面没有预料到尽管信号肽和肽原的位置位于蛋白上的“错误”位点处，但蛋白的折叠也能成功进行，并且蛋白的活化也能够按照需要发生。

特别是，根据本发明意外地发现，通过在洗涤剂酶上进行环状变换方法，可以发现与起始分子相比表现出改进性质的新的洗涤剂酶。

因此，本发明的第一个目标是蛋白的成熟蛋白的环状变换变异体的编码DNA的制造方法，所述蛋白特别是酶，被天然表达为前蛋白、蛋白原和/或前蛋白原，其中对成熟蛋白的编码DNA实施了环状变换方法。

因此，本发明的目标也是选自下列的多核苷酸：

a)蛋白的成熟蛋白的环状变换变异体的编码多核苷酸，所述蛋白特别是酶，被天然表达为前蛋白、蛋白原和/或前蛋白原、，

b)(a)的多核苷酸的突变体，与(a)的多核苷酸相比具有至少80，优选至少85或90％，特别优选至少95、98或99％的序列同源性和/或序列同一性，其中序列比较在一个实施方案中参照不带有桥接接头的编码多核苷酸的环状变换多核苷酸，在另一个实施方案中参照包含桥接接头的编码多核苷酸的环状变换的多核苷酸，

c)(a)的多核苷酸的突变体，与(a)的多核苷酸的多核苷酸序列相比，具有多达50、40或30个，优选多达25、20或15个，特别优选多达10、9、8、7或6个，特别是多达5、4、3、或2个核苷酸的取代、插入、缺失或倒位，特别是具有正好一个核苷酸的插入或缺失，其中序列比较在一个实施方案中参照不带有桥接接头的编码多核苷酸的环状变换的多核苷酸，在另一个实施方案中参照包含桥接接头的编码多核苷酸的环状变换的多核苷酸，

d)包含有(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸，

e)编码本发明的环状变换变异体的多核苷酸，

f)含有与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多核苷酸互补的序列的多核苷酸。