[发明专利]核碱基表征

说明书

技术领域

本发明提供修饰的核碱基化合物、修饰的核酸模拟化合物及其各种应 用。更具体地，本发明提供用于核碱基表征、SNP表征和核酸测序的方法。

背景技术

尽管已经公开了两种原创的DNA测序方法-Maxim和Gilbert(A.M. Maxam和W.Gilbert，PNAS，1977，74，560-564)的化学法和Sanger(F.Sanger 等人，PNAS，1976，5463-5467)的基于酶的方法，但目前使用的主流方法基 于Sanger的方法和所谓的终止或双脱氧测序。其基本的方法学基于部分终 止延伸的DNA链以产生一系列标记的终止片段，其需要尺寸分离用于要 进行的序列分析。自从其创建以来已经作出了许多显著的改进，由此标记 已经从传统的放射性核苷酸转变为荧光染料，并且在高通量应用中常常使 用毛细管电泳(尽管经常填充聚合物)而不是平板式凝胶电泳。其结果是大 规模地提高了并行性，诸如96根毛细管的同时运转，在单通道中使用4 种染料和分析，同时荧光灵敏度的提高和更有效的聚合酶允许更长的测序 轮次。然而，从对人类基因组测序所需要的巨大努力可看出这样的事实， 即该方法具有一些固有的局限性。

在过去几年中已经报道了许多较新的方法，这些方法实际上分为三 类：(i).通过反复引入单碱基的测序，(ii)焦磷酸测序以及(iii)采用解旋/ 解码的限制性酶介导的裂解或激酶连接反应。

(i).通过反复引入单碱基的测序。在此领域有许多报道(Z.M.Li等人， PNAS，2003，100，414-419；T.S.Seo等人，PNAS，2005，102，5926-5931；L.R. Bi等人，J.Am.Chem.Soc，2006，128，2542)。该方法依赖于酶介导的将单 个碱基引入至增长的引物DNA链。单碱基引入受三磷酸盐的一些修饰的 控制，使得不可能引入多个碱基。其可以是核苷酸或化学区块上的物理区 块(例如，3′OH基团上的酯)。此方法依赖于荧光标记的构件并且一般在去 除封闭基团后也将裂解荧光报告基因，使得能够接受另一循环的反应。此 方法有许多问题，因此需要酶和复杂的三磷酸盐。裂解和终止化学也有许 多问题，其基本上需要是定量的从而能够有适当的阅读长度。

(ii).焦磷酸测序(P.Nyren等人，Anal.Biochem.，1996，242，84-89)。在 此方法中，用酶和四种三磷酸盐之一处理增长的引物DNA链。如果掺入 碱基，则释放焦磷酸盐；如果没有掺入碱基则不生成焦磷酸盐。焦磷酸盐 与硫酸化酶反应，在APS(腺苷-5′-磷酸硫酸酐)的存在下硫酸化酶将其转变 为ATP。然后用另一酶(荧光素酶)处理以生成光。正是此光被用来确定向 增长的DNA链的具体碱基的引入作用或其它。如果在同一时间引入两个 或多个相同类型的碱基，则生成更多的光，并且此可被定量。然后用下一 类型的三磷酸盐重复该过程，使序列生成。该方法有许多问题，包括下列 的事实，即对发光的定量不一定可行，因此单碱基的一段稍长的序列基本 上不可能被读出(例如，由于发射变化使得实际上不可能区分14或15个一 种类型的碱基)。在最近的描述从排列在微孔中的数百万个珠子中测序的一 篇文章中使用的正是该方法。(M.Margulies等人，Nature，2005，437， 376-380)。

(iii).采用解旋/解码的限制性酶介导的裂解或连接反应(S.Brenner等 人，Nature Biotech.，2000，18，630-634)。在此方法中，用限制性酶裂解序 列以得到悬垂序列。然后使用一系列16个被编码的接头将它们解码。然 后这些接头自身裂解，暴露于要被解码的下一组碱基。利用连接反应的类 似方法是可能的。该方法也有一些问题：每次解旋需要多个步骤；仍然需 要标记的探针和多种酶；裂解不完全或不合乎需要的裂解等等。这就是 Brenner(S.Brenner等人，Nature Biotech.，2000，18，630-634)以及Shendure 和Church在其基于大规模并行芯片(包埋在聚丙烯酰胺凝胶中的珠子，J. Shendure等人，Science，2005，308，1728-1732以及R.D.Mitra等人，PNAS， 2003，100，5926-5931)的测序中所使用的方法。