[发明专利]用于检测生物靶点的快速和灵敏的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过自由基链式反应发生的生物标记方法。本文中所述的标记反应可通常用于检测试验方案(其用于检测并使生物或化学靶可视化)的宿主中的靶，所述试验方案包括免疫组织化学法(IHC)、原位杂交法(ISH)、抗体基染色法(例如ELISA、DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法)和其他方法。

背景技术

使用可检测标记来检测样品中的生物靶或化学靶为处于多种生物诊断和检查方法的核心部分的过程。在一些情况下，所述靶可为原位或者在提取或分离后以DNA或RNA水平检测的特定聚核苷酸序列或基因、基因变体、基因表达谱。在其他情况下，所述靶可为原位或者在分离或实验室操作后再次检测的肽、蛋白、抗原或其他物质。所述靶还可以为有机来源物质的颗粒或碎片。

许多典型检测方法，例如IHC、ISH、ELISA或印迹法，使用标记方案来检测所需的靶。典型地，这些方案包括将潜在含有可检测的靶的试验样品和探针一起孵育，然后检测探针和具有可检测标记的靶之间的结合，例如可释放颜色、荧光信号或放射线。取决于使用方案的特异性，一个或多个探针分子可与各靶结合。在一些情况下，特别当存在的靶的浓度较低时，需要通过将一个或多个放大层加入系统中来放大来自靶-探针结合的信号。例如，如果探针为识别靶的第一抗体，可加入识别第一抗体探针的第二抗体，使得多个第二抗体与各第一抗体结合。如果第二抗体与可检测标记(例如荧光团或发色团)相连，那么通过放大，样品中的各靶分子可有效地与多个荧光团或发色团结合而不是仅与一个或几个荧光团或发色团结合。因此，靶在放大后将产生更强的检测信号。

然而，一些检测试验具有产生看起来相对扩散的信号的趋势，如果样品被允许在分析前静置一段时间尤其是如此。例如，与靶结合的一个或多个探针和/或可检测标记会随着时间缓慢地从所述靶扩散分开，或者彼此扩散分开。在一些情况下，影响靶、探针和放大层的结合亲和性的缓冲液的改变也可以引起信号扩散。许多可检测标记通过非共价相互作用(例如蛋白-配体结合或聚核苷酸杂交)而与靶结合。在标记后缓冲液的改变可降低靶、探针和可检测标记之间的亲和性，从而使各种组分解离。在一段时间(例如数日)内简单的扩散还可引起靶、探针和可检测标记之间的解离，从而引起信号扩散。

现有技术仅仅描述了非常少的允许克服上述问题的技术，但仍仅是部分的。这种技术的一个例子是US 5,863,748、5,688,966、5,767,287、5,731,158、5,583,001、5,196,306、6,372,937或6,593,100中所述的催化的报道子沉积(CARD)法。该方法使用所谓的“分析物依赖性酶活化系统”(ADEAS)来催化可检测标记沉积在分析平台的固相上。在分析方式中，ADEAS包含的酶与由对该酶具有特异性的可检测地标记的底物构成的偶联物发生反应。当酶和偶联物反应时，形成活化的偶联物，所述活化的偶联物共价沉积在固定活化的偶联物的特异性受体的位点处。因此，由于偶联物包含标记，其具有指示位点中靶的存在的报道子的作用。酶沉积的标记可被直接或间接检测。该方法导致信号放大和改善的检测限。

CARD法可用于分析方式中，其中待检测的靶为固定在固相载体(例如膜)上的受体。这种分析方式包括夹心免疫分析和膜基核酸杂交分析。如US6,593,100中所述，CARD法还适用于通过(例如)免疫组织化学法(IHC)来检测生物靶点。US6,593,100中所述的方法利用在增强剂存在的条件下、辣根过氧化物酶(HRP)和包含HRP底物的标记的偶联物之间的反应。HRP底物和增强剂都是酚的衍生物。在与HRP反应时，HRP底物被活化并且与样品(例如蛋白)的受体位点结合。

尽管具有一些有利的特征(例如增加的检测灵敏度)，但是该方法被限于报道分子，且所述报道分子为选自酪胺或对羟基肉桂酸、或它们的衍生物的标记的HRP底物。

本发明克服了上述CARD法的限制，并且提供一种用于快速和灵敏地检测生物和化学标志的新方法。该方法包括CARD法的有价值的特征和这样的新的特征，该新的特征使该方法适用于更宽范围的分析方式并且独立于报道分子的窄的选择，以及允许快速、精确和灵敏地检测多种生物或化学靶。

发明概述