[发明专利]靶RNA的检测、定量方法和试剂盒

权利要求书

1.靶RNA的检测、定量方法，其特征在于包括以下的(a)～(j)的工序：

(a)将含有与靶RNA的5’端靶特异性序列相对应的DNA序列的引物的5’末端固定在基板表面，制备固相DNA(+)引物的工序；

(b)在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列，制备液相cDNA(-)引物的工序；

(b’)根据需要，制备在标签序列的5’末端附加RNA聚合酶启动子序列的液相通用引物的工序；

(c)制备含有靶RNA的3’端序列和5’端靶特异性序列的试样RNA的工序；

(d)使工序(b)中制备的液相cDNA(-)引物与工序(c)中制备的试样RNA链在液相中接触，使液相cDNA(-)引物与试样RNA杂交，然后通过逆转录酶使DNA(-)链延长，制备cDNA链-RNA链复合体的工序；

(e)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(d)中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备单链DNA(-)的工序；

(f)使工序(e)中制备的单链DNA(-)与工序(a)中制备的固相DNA(+)引物在液相中接触，使单链DNA(-)与固相DNA(+)引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶使DNA(+)链延长制备双链DNA的工序；

(g)使RNA聚合酶作用于工序(f)中制备的双链DNA，利用来自DNA(-)链的RNA聚合酶启动子序列使单链RNA(-)扩增，使扩增的单链RNA(-)与固相DNA(+)引物杂交，然后通过逆转录酶使DNA(+)链延长制备cDNA链-RNA链复合体的工序；

(h)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(g)中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备固相单链DNA(+)的工序；

(i)使工序(h)中制备的固相单链DNA(+)与工序(b)中制备的液相cDNA(-)引物或工序(b’)中制备的液相通用引物在液相中接触，使单链DNA(+)与液相cDNA(-)引物或液相通用引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶使DNA(-)链延长，制备双链DNA的工序；

(j)对工序(f)和工序(i)中制备的双链DNA进行定量的工序。

2.如权利要求1所述的检测、定量方法，其特征在于：重复两次以上工序(g)～工序(i)。

3.如权利要求1或2所述的检测、定量方法，其特征在于：在同一反应液中进行工序(d)～工序(j)。

4.如权利要求1～3中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于：在同一基板上对多个靶RNA进行检测、定量。

5.如权利要求1～4中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于：在工序(i)中使用液相通用引物。

6.如权利要求5所述的检测、定量方法，其特征在于：液相通用引物的浓度为液相cDNA(-)引物浓度的10倍以上。

7.如权利要求1～6中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于：液相cDNA(-)引物是通过标签序列，在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列制成的液相嵌合引物。

8.如权利要求1～7中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于：使用RNA聚合酶启动子序列是标记的启动子序列的液相通用引物或液相嵌合引物。

9.如权利要求8所述的检测、定量方法，其特征在于：标记的启动子序列是生物素标记的启动子序列。

10.如权利要求1～7中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于：在标记试剂的存在下进行工序(i)。

11.如权利要求10所述的RNA的检测、定量方法，其特征在于：标记试剂为荧光色素。

12.如权利要求1～11中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于：使用逆转录酶作为具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶。

13.如权利要求1～12中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于：靶RNA为16SrRNA中的菌特异性RNA链。

14.使用权利要求1～13中任一项所述的RNA的检测、定量方法，对一种或多种病原微生物进行检测、定量的方法。