[发明专利]靶RNA的检测、定量方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及靶RNA的检测、定量方法和试剂盒，更具体而言，涉及组合了DNA微阵列技术和核酸扩增技术的RNA的检测、定量方法以及RNA的检测、定量试剂盒。

背景技术

关于细菌的鉴定，除了以往一直在使用的通过培养的鉴定方法、通过染色进行的鉴定方法、或测量ATP等涉及细菌的代谢的物质的方法之外，正在开发出例如使用DNA微阵列技术的细菌鉴定方法。特别是合成相对于某细菌的基因序列具有特异性碱基序列的核酸作为探针，并将其固定在基板上使其与由检样扩增的基因杂交的方法，由于使用各菌种所具有的特异性碱基序列，因此可以进行准确检测，目前各种形式的应用正在发展(参照专利文献1～3和非专利文献1)。

例如，作为定量解析方法中的一种，例如有采用实时PCR法的检测方法。利用这种实时PCR法时，可以用微量的检样量进行定量检测，但检验需要时间，另外，为了重现性良好地进行定量，需要预先调查每个模板或引物适合定量的循环数，操作繁琐。

此外，作为可以检测出特定菌种或品种的方法，提出了作为RNA特异性核酸扩增方法的基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid SequenceBased Amplification，NASBA)法。NASBA法是用2种引物在对象RNA上对互补的反义RNA进行扩增的方法，由于可以在41℃的恒定温度下，以RNA作为模板在短时间内进行核酸扩增，因此可以在常温下进行反应，而不需要温度调节设备等。另外，由于也不需要考虑引物的Tm值等，因此可以简便地检测多种核酸。此外，由于与RT-PCR不同，可以在DNA存在下进行RNA的扩增和检测，因此可以通过评价细菌的存活来排除由死亡细菌造成的假阳性的可能性。但是，NASBA法虽然可以同时简便地定性检测多种核酸，但一直难以简便地定量检测多种核酸。

另一方面，肺炎在日本人的以死因区分的死亡率(cause-specificdeath rate)中位于第4位，作为癌症等基础疾病的并发症经常发生，作为患者数量非常多的疾病而被人们所知。以往作为成为肺炎原因的微生物(病原菌)的探索试验而进行的培养检验至少需要数天时间，如果再对培养后的病原菌进行药物敏感性试验则要花费近1周的时间，因此不是十分有助于治疗选择的检验方法。有报告指出对于需要在重症监护病房(ICU)住院的重症肺炎，迅速且准确地确定病原菌在治疗选择中极为重要，恰当的初期治疗可以切实地提高肺炎患者的获救概率。但实际上，现状是由于仍然未确立代替培养法的病原菌鉴定技术，因而必须在病原菌不明的状态下进行治疗。因此，不得不根据经验治疗使用抗生素，结果可能导致耐药菌的出现。

成为肺炎原因的病原菌中，发生频率高的菌种占全部的近50％，包括病毒在内的主要病原菌为20～30种左右。其中有无法用常用方法培养的病原菌，通过培养法难以确定病原菌的情况也很多。另外，利用使用以往的DNA微阵列技术的微生物检测方法时，对于即使是微小的感染量也会引起肺炎的肺炎病原菌的检测、或者同时检测多种菌来说是有效的，但在重现性良好地进行定量解析方面存在问题。特别是在需要依靠菌量来适当选择抗生素进行治疗的肺炎中，同时检测多种肺炎病原菌、以及检测信号的定量解析是非常重要的。此外，最佳治疗药物根据病原菌的种类不同而不同，但在确定病原菌前就开始治疗的情况在医疗伦理上也是不得已的实情。为了解决这些问题，有待开发可以从多种菌种中迅速且定量地检测特定菌的方法。

专利文献1：日本特开2002-512688号公报

专利文献2：日本特开2006-025791号公报

专利文献3：日本特开2006-061155号公报

非专利文献1：Schena M.等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93(20)：10614-9

发明内容

本发明的课题在于，提供在对一种或多种病原微生物进行检测、定量等情况下，可以从试样中微量的RNA中简便且迅速地检测、定量靶RNA的方法和试剂盒。