[发明专利]在谷氨酸棒状杆菌中从蔗糖生产氨基酸的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年9月26日提交的第60/955,348号在审美国临时专利申请的优先权。将所述申请通过引用整体并入本文。

背景技术

1.技术领域

本发明总的涉及用棒状杆菌(Corynebacterium)属或短杆菌(Brevibacterium)属细菌以蔗糖为碳源来生产氨基酸的方法和组合物。本发明更具体涉及用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)以蔗糖为碳源生产L-赖氨酸。

2.相关技术

许多棒状杆菌或短杆菌的商业发酵用葡萄糖作为碳源。因此，设计许多细菌生产培养物，以用葡萄糖为碳源优化产率和/或产量。生产商业上重要的氨基酸-L-赖氨酸已成为特定的优化目的。

由于成本和其它可能的考虑，某些地区优选使用替代性的非葡萄糖碳源。一种可能的非葡萄糖碳源是蔗糖。蔗糖可以从例如甘蔗和甜菜中得到。不幸的是，由于微生物通常以与葡萄糖不同的方式输送和利用蔗糖，以蔗糖为碳源，由许多微生物生产目的氨基酸或精细化学品会遭受产率下降。这尤其可能是因为用蔗糖作为碳源的微生物本被设计为在葡萄糖中最好地生长。谷氨酸棒状杆菌便是这样，它是最普遍用于通过发酵来生产氨基酸(如L-赖氨酸)的微生物之一。

Wittmann et al.，″Metabolic Fluxes in Corynebacteriumglutamicum during Lysine Production with Sucrose as CarbonSource，″Appl.&Enviro.Microbiol.70(12)：7277-7287(2004)提示了谷氨酸棒状杆菌中利用蔗糖的代谢途径。Wittmann等人假定谷氨酸棒状杆菌中存在磷酸转移酶系统(PTS)作用产生的蔗糖摄入机制，其中蔗糖在葡萄糖环处被磷酸化，随后在细胞中被水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖。谷氨酸棒状杆菌中的PTS是一般的糖类转移系统，该系统利用两种通常共享的胞质蛋白的组合，所述两种蛋白被称为酶I和Hpr，分别由ptsI和ptsH基因编码，它们和离散的膜结合EII蛋白复合物集相互作用，所述复合物分别被称为果糖-pts、蔗糖-pts、和葡萄糖-pts，分别由ptsF、ptsS、和ptsG基因编码，它们分别优先转运果糖、蔗糖和葡萄糖(Tanaka et al，Microbiology(2008)154，264-274)。还有两个被称为HCg12933和NCg12934的编码具有未知特异性的蛋白的pts基因。

Wittmann等人也提示水解后产生的果糖从细胞中分泌出，然后通过果糖-PTS摄入系统和甘露糖PTS摄入系统(现在认为后者和葡萄糖-PTS相同)再输入。存在多种蔗糖摄入系统(蔗糖-PTS、果糖-PTS、和葡萄糖-PTS)，因而假设存在多种碳进入细胞的入口是对蔗糖的表现不佳的原因。

用葡萄糖生成赖氨酸的过程中，大约65％的碳进入磷酸戊糖途径(PPP)而用于生产NADPH，所述NADPH用于合成赖氨酸。然而，用蔗糖生成赖氨酸的过程中，认为只有很小百分比的碳进入PPP，因为略少于半数总碳作为果糖-1，6-磷酸进入糖酵解。

如图1所示，当野生型谷氨酸棒状杆菌在蔗糖中生长时，认为约90％会进入谷氨酸棒状杆菌细胞的果糖作为果糖-1-磷酸通过果糖-PTS进入。果糖-1-磷酸经磷酸化而生成果糖-1，6-二酸。认为果糖-1，6-磷酸不经过PPP途径，很大一部分是因为6-磷酸果糖激酶主要是不可逆酶，并且在蔗糖上生长的谷氨酸棒状杆菌中罕有果糖-1，6-二磷酸酶活性。因此，果糖-1，6-二磷酸将优先进入糖酵解和TCA循环，其不能为商业水平的赖氨酸合成提供还原力。

约10％的进入谷氨酸棒状杆菌的果糖被认为以果糖-6-磷酸的形式被葡萄糖-PTS系统摄入。果糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸异构酶的作用下直接进入PPP，所述葡萄糖-6-磷酸异构酶朝糖异生方向发挥作用而从果糖-6-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸。谷氨酸棒状杆菌中一条建议的蔗糖利用的代谢途径包括糖酵解和PPP旁路，如图1所示。