[发明专利]内毒素浓度测定方法及浓度测定用试剂盒

权利要求书

1.一种内毒素浓度测定方法，用于测定样品中所含的内毒素的浓度，其特征在于，包括；

发光底物游离步骤，使样品、含有与内毒素结合而活化的C因子的试剂及在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从该合成发光底物中游离出所述发光底物；

发光量测量步骤，使发光酶作用于通过所述发光底物游离步骤游离出的发光底物，并测定发光量；和

浓度定量步骤，根据通过所述发光量测量步骤得到的测定值定量所述样品中的内毒素浓度。

2.如权利要求1所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述合成发光底物具有通过所述C因子活化而生成的活化型C因子、活化型B因子及凝固酶中的任何一种的作用使所述发光底物与所述肽之间的键被切断的结构。

3.如权利要求2所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述发光底物是氨基荧光素，所述发光酶是荧光素酶。

4.如权利要求3所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述荧光素酶来自于选自由北美萤、源氏萤、平家萤、小真菌蚋、姬萤、窗萤、北方锯角萤、发光叩头虫和铁路蠕虫组成的组中的甲虫。

5.如权利要求3或4所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述荧光素酶是变异型荧光素酶，该变异型荧光素酶改变了野生型荧光素酶的氨基酸序列，使发光强度比野生型荧光素酶增强。

6.如权利要求5所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述变异型荧光素酶为选自由以下(i)～(v)组成的组中的一种：

(i)包含将序列编号13所示的野生型北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮氨酸取代为亮氨酸，第436位的天冬氨酸取代为甘氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶；

(ii)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮氨酸取代为亮氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶；

(iii)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第436位的天冬氨酸取代为甘氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶；

(iv)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮氨酸取代为亮氨酸，第436位的天冬氨酸取代为甘氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶；

(v)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第47位的异亮氨酸取代为苏氨酸，第50位的天冬氨酸取代为丝氨酸，第59位的蛋氨酸取代为苏氨酸，第252位的苏氨酸取代为丝氨酸，第423位的异亮氨酸取代为亮氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶。

7.如权利要求1～6中任一项所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述含有C因子的试剂为鲎血细胞提取成分，该鲎血细胞提取成分相对于反应体系总量的蛋白质浓度为1.5mg/mL～3.5mg/mL。

8.一种内毒素浓度测定用试剂盒，其特征在于，包含含有与内毒素特异性结合而活化的C因子的试剂、在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物和发光酶作为构成成分。