[发明专利]内毒素浓度测定方法及浓度测定用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及样品中所含的内毒素的浓度测定方法及浓度测定用试剂盒。具体而言，涉及利用生物发光反应的内毒素浓度测定方法及浓度测定用试剂盒。

背景技术

“内毒素(endotoxin)”是革兰氏阴性细菌外膜的构成成分之一，其活性主体为脂多糖(LPS，lipopolysaccharide)。生物体内的内毒素在革兰氏阴性细菌的表层作为外膜的一部分而存在。另外，通常在革兰氏阴性细菌死亡后，以游离内毒素的形式游离存在于血流中。

内毒素在血液中存在一定量以上时，由于该内毒素的刺激，单核细胞或粒细胞等产生过量的炎症性细胞因子。结果引起称为内毒素血症的发热、败血症、败血症性休克或多器官衰竭等症状。因此，注射用医药品等中的内毒素的检测极为重要，日本、美国和欧洲的药典中都收录了内毒素试验方法。另外，在临床诊断上，认为准确测定血液中的内毒素，对于早期诊断和治疗效果的判定是极为重要的。

作为现有的内毒素测定方法，已知有将待测样品直接注射到兔体内，根据其体温升高测定内毒素量的热原(pyrogen)试验，以及利用鲎的血细胞提取液(amebocyte lysate)因内毒素而凝胶化的现象的鲎试剂试验。其中，直接向兔体内注射的方法，在成本方面、获得结果所需的时间及灵敏性方面存在问题，因此，目前主要采用鲎试剂试验作为内毒素的测定方法。

图1表示由内毒素引起的鲎血细胞提取液的凝胶化反应的过程。在鲎血细胞提取液中存在与内毒素发生特异性反应的C因子途径。“C因子途径”由以下级联反应构成。首先，内毒素与C因子(Factor C)牢固结合而使C因子活化。接着，由内毒素的结合而活化的C因子(活化型C因子)使B因子(Factor B)活化。然后，活化的B因子(活化型B因子)进一步使凝固酶原(proclotting enzyme)活化而生成凝固酶(clotting enzyme)。该凝固酶使作为其底物的凝固蛋白原(coagulogen)部分水解。结果，从凝固蛋白原中游离出C肽(peptide C)，生成凝固蛋白(coagulin)。由于该凝固蛋白的凝固作用而产生凝胶化(参考非专利文献1)。

利用鲎试剂试验的内毒素测定方法，应用了上述的鲎血细胞提取液因内毒素而凝胶化的过程。鲎试剂试验根据判定方法或测定方法的不同，已知有：凝胶化翻转法(凝胶化法)、合成发色底物法(比色法)以及比浊时间分析法(比浊法)等方法(参考非专利文献2)。

“凝胶化翻转法”是将待检测样品与鲎血细胞提取液在试管内混合，在一定条件下(例如37℃下30～60分钟)使其反应后，在将该试管翻转或倾斜时，通过样品是维持液态还是固化来进行判断的方法。前者的情况下为内毒素阴性，后者的情况下为阳性。该方法虽然无需特别的装置，操作也较容易，但是测定结果容易因原料和制造批次的不同而改变，而且由于由人进行判断因而与光学方法相比存在欠客观的问题，因此通常只用于粗略测定。

“合成发色底物法”是使用合成发色肽底物作为凝固酶的底物，根据吸光度对游离出的发色基团量进行比色定量，由此计算内毒素量的方法。合成发色肽底物是模仿天然底物凝固蛋白原中的凝固酶水解位点的氨基酸序列的合成底物。使对硝基苯胺(pNA)等发色基团结合在凝固酶的切割位点上，该发色基团通过酶切游离出来而发色。当发色基团为对硝基苯胺时，随时间推移测定对硝基苯胺的最大吸收波长405nm的吸光度。另外，当发色基团为对硝基苯胺的重氮化偶联物时，随时间推移测定545nm的吸光度。然后，对所得的随时间推移的透光量的变化进行分析，从而测定内毒素浓度。该合成发色底物法虽然也存在试剂价格较高、操作繁杂等问题，但定量性、灵敏性及客观性优良。

“比浊时间分析法”是监测凝胶化导致的浊度增加作为透光量的变化，以反应液的透光量比减少到一定阈值(通常为90％左右)所需的时间作为凝胶化时间，使用根据凝胶化时间与内毒素浓度的关系而制作的标准曲线来计算内毒素值的方法。该方法的定量性和客观性非常优良，但是测定需要专用装置。

此外，有利用重组C因子和荧光底物、能以高灵敏度测定内毒素的试剂盒(商品名：PyroGene-rFc，Lonza Walkersville，Inc.制造，第一化学药品株式会社销售)市售。

非专利文献1：T.Miyata，M.Hiranaga et al.，Amino Acid Sequenceof the Coagulogen from Limulus polyphemus Hemocytes，The Journal ofBiological Chemistry，259，8924-8933(1984)