[发明专利]利用切割序列和间隔子的共振能量转移测定

权利要求书

1.一种构造物，其具有：

定位成提供电子耦合的供体标记和受体标记，这样供体可通过偶极-偶极耦合机制将能量转移至受体；和

置于供体与受体之间的连接体，其具有切割位点序列以及供体与切割位点序列和受体与切割位点序列的至少一个之间的间隔子。

2.权利要求1的构造物，其中供体和受体中的至少一个是荧光基团和生色团中的至少一个。

3.权利要求1的构造物，其中偶极-偶极耦合机制是共振能量转移(FRET)。

4.权利要求1的构造物，其中连接体具有大于等于5nm的一级结构长度。

5.权利要求1的构造物，其中连接体具有大于等于8nm的一级结构长度。

6.权利要求1的构造物，其中连接体具有大于等于12nm的一级结构长度。

7.权利要求1的构造物，其中连接体包含具有至少3个氨基酸的间隔子。

8.权利要求7的构造物，其中连接体包含SNARE基序。

9.权利要求7的构造物，其中间隔子具有至少5个氨基酸。

10.权利要求7的构造物，其中间隔子包含(GGGGS)n，其中n是1至3。

11.权利要求7的构造物，其中间隔子包含(EAAAK)n，其中n是1至3。

12.权利要求1的构造物，其中相对于相应的无间隔子的构造物，间隔子增加电子耦合。

13.权利要求1的构造物，其中间隔子包含SNARE基序。

14.权利要求1的构造物，其中切割位点序列包含SNARE蛋白突变蛋白。

15.权利要求1的构造物，其中切割位点序列包括：

(a)SNARE蛋白、基序、突变蛋白的至少一个，和

(b)具有至少5个氨基酸的间隔子。

16.权利要求15的构造物，其中间隔子包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1至3。

17.权利要求1的构造物，其中构造物选自CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP和CFP-(SGLRSRA)-小突触泡蛋白-(SNS)-YFP。

18.提高供体标记与受体标记之间的能量转移的灵敏性的方法，其包括：

提供包含通过连接体物理偶联的供体标记和受体标记的构造物；

在连接体中包含切割位点序列；和

在连接体中在供体与切割位点序列和受体与切割位点序列的至少一个之间包含间隔子，由此供体与受体之间的电子耦合得到增加。

19.权利要求18的方法，其中构造物是基于蛋白质的构造物，并且连接体是肽序列。

20.权利要求18的方法，其中切割位点序列包括SNARE蛋白或其片段或突变蛋白，以及其中间隔子包含至少5个氨基酸。

21.权利要求18的方法，其中间隔子包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1至3。

22.权利要求18的方法，其中间隔子通过减少供体与受体之间的三级结构的距离来增加供体与受体之间的电子耦合。

23.权利要求18的方法，其中间隔子通过提供供体与受体之间的电子跃迁来增加供体与受体之间的电子耦合。

24.权利要求18的方法，其中将测定用于完整细胞。

25.用于检测肉毒杆菌神经毒素的方法，所述方法包括，

a)提供权利要求1的构造物，其中连接体是待检测的肉毒杆菌神经毒素的底物蛋白或其可切割片段，

b)将构造物在肉毒杆菌神经毒素在其下可切割底物蛋白或其片段的条件下暴露于怀疑含有肉毒杆菌神经毒素的样品，和

c)在将构造物暴露于样品之前和之后检测和比较FRET信号，其中FRET的减少表明样品中存在肉毒杆菌神经毒素。