[发明专利]利用切割序列和间隔子的共振能量转移测定

说明书

本申请要求2007年9月14日提交的临时申请60/972673的优先权，所述临时申请以其全文通过引用合并入本文。

发明领域

本发明的领域是关于与肉毒杆菌(Botulinum)毒素和破伤风毒素相关的蛋白酶测定的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer)领域。

背景

肉毒杆菌神经毒素(BoNT)由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生，其是已知的最强的毒素。此类毒素是食物中毒的公认来源，通常导致受害者的严重损害或甚至死亡。存在7种结构相关的肉毒杆菌神经毒素或血清型(BoNT/A-G)，其各自由重链(大约100KD)和轻链(大约50KD)组成。重链通过受体介导的内吞作用介导毒素进入靶细胞。一旦内化，轻链便从内体小泡腔转移入细胞溶质，并且充当锌依赖蛋白酶(zinc-dependent protease)来切割介导小泡-靶膜融合的蛋白(“底物蛋白(substrate proteins)”)。

此类BoNT底物蛋白包括质膜蛋白突触融合蛋白(syntaxin)、外在膜蛋白SNAP-25和小泡膜蛋白小突触囊泡蛋白(Synaptobrevin)(Syb)。此类蛋白统称为SNARE(可溶性N-乙基马来亚胺敏感因子附着蛋白受体)蛋白。SNARE蛋白的切割阻止了小泡与质膜的融合，从而消除了神经递质在神经肌肉接头的释放。在SNARE蛋白当中，突触融合蛋白和SNAP-25通常存在于靶膜上，从而称为t-SNARE，然而发现小突触囊泡蛋白只与突触内的突触小泡在一起，从而被称为v-SNARE。这三类蛋白一起形成了据认为是介导小泡膜与质膜之间的融合的最小机器的复合物。BoNT/A、E和C¹在单个但不同的位点上切割SNAP-25，BoNT/B、D、F、G切割小突触泡蛋白(Syb)。除了SNAP-25外，BoNT/C还切割突触融合蛋白。

由于它们作为食物中毒源以及生物恐怖主义带来的威胁，存在对灵敏且快速地检测BoNT的需要。目前，大多数检测毒素的灵敏方法是在小鼠中进行毒性测定。该方法需要大量小鼠，非常费时并且不能用于研究毒素催化动力学。已发展了许多基于使用抗毒素抗体的放大免疫测定系统(amplified immunoassay system)，但大部分此类系统需要复杂且昂贵的放大处理，从而也不能用于研究毒素催化动力学。虽然HPLC和免疫测定可用于检测已切割的底物分子和测量此类毒素的酶促活性，但此类方法通常非常费时且复杂，它们中的一些方法需要特殊的抗体，从而使它们不适用于大规模筛查。因此，存在对用于检测BoNT的新型和改进的方法以及组合物的需要。

在FRET测定中，使用两种荧光生成氨基酸衍生物在含有毒素切割位点的非常短的合成肽(20-35个氨基酸)中取代两个天然氨基酸。当它们在肽中彼此靠近时，一个氨基酸衍生物的荧光信号被另一个氨基酸衍生物猝灭，该机制称为“共振能量转移(resonance energytransfer)”(FRET)。肽的切割将两个氨基酸衍生物分开，并且可检测FRET的减少。

FRET测定已被成功地用于检测BoNT。(参见例如，属于Chapman的2003年10月28日提交的美国专利申请2004/0191887，2004年12月20日提交的属于Chapman的美国专利申请2006/0134722，属于Steward的美国专利7208285(2007年4月)和属于Fernandez-Salas的美国专利7183066(2007年2月)，其各自以它们的全文通过引用合并入本文。在合并的参考文献中的术语的定义或用途与本文中提供的该术语的定义不一致或相反的情况下，使用本文中提供的术语的定义而不使用参考文献中该术语的定义)。

虽然已在应用FRET测定来检测BoNT中显示了一些成功，但灵敏性和特异性不足。因此需要改进的装置、系统和方法。

发明概述

本发明提供了装置、系统和方法，其中分子构造物(construct)包括供体标记、受体标记、位于供体与受体之间的连接体肽、具有切割位点序列的连接体(linker)以及(a)供体与切割位点序列和(b)受体与切割位点序列的至少一个之间的间隔子。

在优选实施方案中，将供体和受体标记定位成提供电子耦合(electronic coupling)，这样供体标记可通过偶极-偶极耦合(dipole-dipole coupling)机制将能量转移至受体标记。在特别优选实施方案中，偶极-偶极耦合机制是共振能量转移(FRET)。