[发明专利]用于生成树突细胞的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种用于生成和遗传工程化改造树突细胞(DC)的方法及其用途。

发明背景

在过去多年期间，已经认可树突细胞(DC)为免疫的中心调节物。人DC是通过在存在生长因子(通常为白介素(IL)4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))的情况中从造血干细胞或外周血单核细胞进行的体外分化生成的。最近的证据提示，DC具有柔性地(flexibly)响应微生物、外伤、或代谢应激遭遇的能力。如此，DC不仅分化成能履行特定功能(例如活化或耐受性，1型或2型T辅助淋巴细胞(Th1，Th2)极化)的一种亚型，而且还以适合于给定环境中遭遇的考验的时间-动力学方式呈现独特的功能状态(图1)。

单核细胞离开血流而进入各种组织，并变为通常称为未成熟DC(iDC)的细胞。这些iDC是通过从细胞外液以及来自生理学濒死细胞的凋亡体吸收材料来对其环境取样，进行加工，并在不进行共刺激的情况中以耐受性诱导形式将此材料呈递给T淋巴细胞的哨兵(sentinel)。可以认为耐受性诱导iDC表型是DC的缺省状态。此状态得到维持，直至iDC遭遇危险信号，该危险信号可以是由toll样受体(TLR)传送的病原体相关分子样式(PAMP)、炎性细胞因子、或T淋巴细胞衍生的信号传导(最主要由CD40/CD40L相互作用介导)。此过程称为DC成熟，其与功能改变的顺序一致。这些功能改变在一段约2天的时间里发生，之后DC达到称为成熟DC(mDC)的状态。最显著地，DC开始上调共刺激分子诸如B7家族成员CD80和CD86。这使DC能够向携带能与抗原性肽相互作用的T细胞受体的T淋巴细胞投递活化性而非抑制性信号，所述抗原性肽与DC膜上的主要组织相容性复合体(MHC)分子复合。在此阶段，还发生刺激物依赖性极化，其中DC分泌IL-12以及IL-12家族细胞因子，其有利于1型免疫应答，随后支持由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的细胞免疫。IL-12分泌一般由TLR与其配体结合(例如TLR4与LPS结合)触发，但是也通过可溶性或细胞膜结合的CD40L分子与DC上的CD40的相互作用触发。比较而言，IL-12释放的缺乏触发2型极化，其通过支持B淋巴细胞来启动体液免疫应答。在没有IL-12分泌的情况中启动DC成熟是通过iDC与细胞因子混合物(通常含有TNF-α和PG-E2以及多种炎性细胞因子，包括但不限于I型和II型干扰素、IL-1、或IL-6)的暴露实现的。

IL-12释放在约24小时后停止，指明DC与T淋巴细胞之间的相遇需要在该时间窗内发生以容许有效的1型极化和CTL活化。比较而言，共刺激分子的表达在2天后达到其最大值。因为按照定义，成熟的DC仅在表型方面而不在功能方面以共刺激分子的最大限度表达表征，所以释放IL-12的1型极化DC称为半成熟的(sm)DC。

约2天后，DC达到所谓成熟的阶段。它分化的第二天期间，DC免除其免疫刺激能力，并通过上调介导负调节反馈环的分子来获得免疫抑制特性(图1)。此分化阶段的生物学意义是在严格控制下保持免疫应答的必然性。活化的免疫细胞(特别是实现杀死其它细胞的CTL)对生物体形成相当大的威胁。这以避开其控制的免疫应答的病理学后果：自身免疫性疾病诸如I型糖尿病或多发性硬化例示。因此，遇到成熟信号后第1天期间引发免疫应答的同一DC会在其分化过程的第2天期间使此相同的免疫应答衰减。因此，成熟的DC实际上并不是如最初认为的免疫刺激细胞而是免疫抑制细胞，因此不足以进行目的在于免疫刺激的治疗性干预，诸如其在癌症免疫疗法或治疗微生物疾病中的用途。

辨别未成熟的(耐受性维持)、半成熟的DC(免疫刺激性)、和成熟的(免疫抑制性)DC是重要的(图1)。如上文所概述的iDC维持针对自身抗原的耐受性。smDC已经遇到上文所述成熟刺激物之一，而且已经不可逆地在约2天内分化成mDC。重要的是，仅在那2天的第一天期间，其实现IL-12释放，启动I型免疫极化，和随后支持CTL介导的免疫应答。一旦成熟的DC在一天后进入分化的第二阶段，它便获得免疫抑制特性。免疫学家能常规地通过膜分子诸如CD80、CD83、或CD86的表达来表征mDC。然而，与在几小时内达到最大限度表达，并在24小时后丧失的IL-12相比，这些膜分子仅在48小时后达到其最大限度表达。为了清楚地辨别本文中所描述的IL-12分泌DC与以名称成熟DC常规了解的细胞，选择术语半成熟的DC。非常重要的是，这不应暗示一些种类的功能缺陷，而仅仅是图1中按时间动力学比例的某个分化阶段。smDC在功能上与iDC以及mDC有所不同。