[发明专利]经修饰葡萄糖脱氢酶基因

说明书

技术领域

本发明涉及以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶，催化葡萄糖1位的羟基脱氢(氧化)反应的FAD缀合型葡萄糖脱氢酶(GLD)。更具体的涉及具有改良的底物特异性的：

经修饰GLD多肽、及

编码经修饰GLD的多核苷酸、

所述酶的制备方法、

葡萄糖的测定方法，其特征是使用所述酶、

葡萄糖测定试剂组合物、及

葡萄糖测定用生物传感器等。

此外，在本说明书中若无特别说明，葡萄糖等单糖均指D-型。

背景技术

血中葡萄糖浓度是糖尿病的重要指标。以往，使用葡萄糖氧化酶来测定血中葡萄糖浓度，但葡萄糖氧化酶受到溶解氧浓度的影响，计算值会产生误差，因此近年来不受氧影响的葡萄糖脱氢酶也被广泛使用。

作为不受氧影响的市售葡萄糖脱氢酶，已知有以吡咯喹啉醌(PQQ)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)，但以往的PQQ-GDH存在对麦芽糖或半乳糖等葡萄糖以外的糖也反应的缺点。

对此，本发明人，以FAD作为辅酶，从土曲霉菌(Aspergillus terreus)FERM BP-08578株中发现了新的可溶性GLD(专利文献1)，成功对基因克隆(专利文献2)。这些GLD具有如不受溶解氧的影响，氧化葡萄糖1位上的羟基，对麦芽糖或半乳糖作用性(酶活性)低的至今所没有的优点。

此外，专利文献3中所示的源于淡紫刺糙青霉菌(Penicilliumlilacinoechinulatum)NBRC6231、意大利青霉菌(Penicillium italicum)NBRC32032及米曲霉菌(Aspergillus oryzae)TI株的葡萄糖脱氢酶或专利文献4中公开的源于米曲霉菌(Aspergillus oryzae)BB-56株的葡萄糖脱氢酶也显示出对麦芽糖或半乳糖作用性低。

但是，这些以往的GLD存在底物特异性尚未改进的问题。

专利文献1：国际公开第2004/058958号单行本

专利文献2：国际公开第2006/101239号单行本

专利文献3：国际公开第2007/116710号单行本

专利文献4：国际公开第2007/139013号单行本

发明内容

发明拟解决的技术课题

以往所知的GLD存在对木糖作用的缺点，对于进行木糖吸收实验的患者来说，显示比实际血糖值高的值，故被建议不要使用。

因此，对葡萄糖具有较高特异性的GLD存在需求，而提供该GLD是本发明应解决的课题。

本发明的目的是提供：

解决上述课题，编码具有对葡萄糖反应性及底物识别能力强，同时对麦芽糖及半乳糖，特别是木糖作用性低等特点的经修饰GLD的新基因(多核苷酸)；

使用经该基因重组的转化细胞制备该酶的方法；并且

葡萄糖的测定方法，其特征是使用所得到的酶；

葡萄糖测定试剂组合物；及

葡萄糖测定用生物传感器等。

解决课题的技术方案

本发明涉及以下各种实施方式。

【实施方式1】经修饰葡萄糖脱氢酶(GLD)，其

●在SEQ ID NO：1所示的野生型FAD缀合型葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列中包含选自下列位的氨基酸的至少1个氨基酸残基的置换：37、69、72、73、76、78、102、217、228、240、356、407、424、437、527和530位的氨基酸；且

●木糖作用性/葡萄糖作用性相比野生型GLD降低。

【实施方式2】实施方式1的经修饰葡萄糖脱氢酶，其中所述木糖作用性/葡萄糖作用性相比野生型GLD降低至0.85倍以下。

【实施方式3】实施方式1或2的经修饰葡萄糖脱氢酶，其中氨基酸置换选自：

●D72A、G73D、G73A、G73S、G73C、G73Q、G73W、G73Y、G73E、G73H、R102H、Y228H、V356A及P527L；且

●S37V、S37G、T69I、L76F、F78L、R102V、N217S、P240I、P240L、Q407A、Q407S、Y424S、A437I及T530A。

【实施方式4】经修饰葡萄糖脱氢酶，其在SEQ ID NO：1所示的野生型FAD缀合型葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列中具有选自下列的氨基酸置换：