[发明专利]检测DNA损伤的设备和方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测细胞DNA损伤的设备和原位方法。本发明特别适合在彗星测定(Comet assay)中使用并且特别适合于自动化。

背景技术

细胞DNA完整性的损伤可以通过多种机制发生。可以通过由于摄取或吸收与DNA反应的药物或其它化学剂而产生的化学反应造成DNA断裂(Exon，J.H.，J.Toxicol.Environ.Health B Crit.Rev.，(2006)，9(5)，397-412)。备选地，可以通过物理方式，如暴露于电离辐射(Brendler-Schwaab，S.等，Mutat.Res.，(2004)，566(1)，65-91)，单独地，或与化学剂组合通过光化学机制，引起DNA损伤。任何这种DNA损伤均有可能在细胞所携带的遗传信息中导致遗传性缺陷，并因此加强了癌的发展。

监管方针要求全部注册药物在一组测定中进行DNA损伤评估。这些测定包括细菌中基因突变的测量和哺乳动物细胞中DNA损伤的体外和体内测定。进行所述测定通常极其费时并且十分昂贵(约50000美元/化合物)，并因此倾向于限制在药物发现过程的末期。在药物开发初期，准确预测毒性的失败或不能准确预测毒性的费用估计每年高达80亿美元，约为全部药物失败费用的30％(2004年12月，剑桥健康技术研究所生命科学进步报告：毒理基因组学和预测毒理学：市场和行业展望(Cambridge Healthtech Advances Life Sciences Report Dec 2004：Toxicogenomics and Predictive Toxicology：Market and Business Outlook))。除新药测试之外，监管活动的增加将测试扩展到其它化学品和材料，如意欲用于人类消费或使用，或可以间接或偶然消费或摄取的食品染料和化妆品(OECD化学品测试指南：新指南487的草案，2004年6月(OECD guideline for the testing of chemicals，draftproposal for a new guideline 487，June 2004))。

除对新近开发的药物和其它化学品进行DNA损伤诱导测试外，越来越多的证据表明环境因素可以促成DNA损伤，包括饮食(Young，G.P.，Forum Nutr.，(2007)，60，91-6)、污染(Moller，P.，Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.，(2006)，98(4)，336-45)，和职业暴露于诱变剂(Faust，F.等，Toxicology，(2004)，98(1-3)，341-50)。广泛的化学、物理和生理化学机制引起DNA损伤的可能性需要可用于通过分析采自个体的血液、细胞或组织样本中的DNA损伤以筛选和监控处于风险中的个体的方法(Lee，E.等，Toxicol.Sci.，(2004)，81(1)，121-32)。

彗星测定(Comet assay)是检测哺乳动物细胞中DNA损伤的单细胞电泳测定(Ostling，O.，Johanson，K.J.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(1984)，123(1)，291-8)。细胞暴露于引起DNA损伤的化合物可以在基因组DNA中产生单链或双链断裂以及化学修饰。在彗星测定中，将处理后的细胞包埋在琼脂糖中、裂解并用碱处理以使DNA变性。随后的电泳导致远离核的碎片DNA迁移和/或染色质松弛，以此产生了彗星的外观(由此命名该测定)并通过荧光显微镜成像。将从彗星头部释放到尾部中的DNA的量定量为DNA损伤的量度。

由于彗星测定非常敏感、提供单细胞统计并且仅需要少量细胞样本，因此它已广泛用于评估基因毒性(具有导致遗传性缺失或突变可能性的DNA损伤)。实施该测定最常用的是淋巴细胞，但是近期的发展集中在使用可以通过微创手术获得的细胞，如来自口腔拭子的口腔细胞(Szeto，Y.T.等，Mutat.Res.，(2005)，578(1-2)，371-81)。