[发明专利]适于表达用于基因治疗的编码序列的表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及用于基因治疗的表达载体，更特别地涉及包含转录调控元件(顺式调控元件或者反式作用元件)新组合的用于基因治疗的表达载体，其包括启动子、增强子、内含子、非翻译区(UTR)和基因座控制区(locus control region，LCR)，所述载体能够支持靶基因在肝中以高水平持续表达。

背景技术

肝的功能包括血液储存、糖转换和分泌多种细胞因子，以及表达影响许多疾病(如遗传的、心血管的、代谢的、血液的和癌性疾病)的基因。已将多种肝特异性疾病(如感染性肝炎)作为基因治疗的靶标进行了研究。

肝细胞在形成后拥有很长的寿命，具有大多数病毒基因转运蛋白的受体而且直接与血流相连，使其易于接触药物，因此肝被认为是基因治疗的重要候选器官。

血友病是一种由位于X染色体上的因子VIII(FVIII、f8)或因子IX(FIX、f9)基因的缺陷所引起的退行性出血疾病，依据突变或缺失的基因将其分成血友病A(FVIII缺陷)或B(FIX缺陷)。对用于治疗血友病A或B的药物，只有当FVIII或FIX以其正常血液浓度的1-5％(分别为100-200ng/ml和500ng/ml)或更高水平持续表达时，治疗效果才是可预期的。

在最近的血友病B基因治疗研究中，已报道的是，将带有人FIX(hFIX)基因的腺相关病毒(AAV)引入血友病B小鼠模型中导致hFIX蛋白以高达1,500-1,800ng/ml的水平表达(Snyder，R.O.，Nat.Med.，5：64-70(1999)；Manno，C.S.，Nat.Med.，12：342-347(2006))，而在血友病B的狗模型中以高达730ng/ml的水平表达hFIX蛋白(Arruda，V.R.，Blood，105：3458-3464(2005))。然而，当将这种在动物模型中高效表达的载体临床应用于人患者时，FIX的血液浓度仅为185ng/ml或更低，这低于有效临床治疗的阈值(500ng/ml)，另外的难题是在人受试者中的hFIX表达水平不是持续的而是瞬时的(Kay，M.A.，Nat.Genet.，24：257-261(2000)；Manno，C.S.，Nat.Med.，12：342-347(2006))。在血友病A的治疗模型中发现了与上述相似的趋势。

针对遗传疾病(如血友病)治疗的临床试验结果表明，首要条件是开发能够保持在特定组织(如肝组织)中持续高水平表达治疗基因的高效组织特异性表达载体。此外，逃脱针对载体的体液及细胞免疫应答以及诱导对所表达蛋白的免疫耐受被认为是成功的基因治疗的关键因素。例如，为了将正常FVIII或FIX的表达水平提高到有效用于成功的临床治疗的阈值，还必须考虑的是，注射高剂量的带有FVIII或FIX基因的病毒并且抑制体内的免疫应答。然而为使这种方法获得成功，首先要通过改进表达载体来提高基因表达的效率。