[发明专利]链球菌溶血素O的突变形式

说明书

本申请要求2007年12月21日提交的US61/016193和2008年8月13日提交的US61/088381的优先权，其内容通过引用纳入本文。

发明领域

本发明涉及免疫学和疫苗学领域。

发明背景

链球菌溶血素O(SLO；GAS25)是人病原体酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GAS)的一种最重要的致病因子。由于它能激发人的早期且强烈的免疫应答，因此通常用作GAS感染的诊断标记物。

SLO属于高同源性巯基激活的溶细胞素(TACY)家族，该家族通过与细胞膜上的胆固醇相互作用、自发寡聚化以及形成穿孔发挥其溶细胞活性。此外，它们能够结合人IgG的Fc区从而直接激活经典补体途径，这可导致对宿主细胞的补体介导的直接攻击。TACY也通过诱导细胞因子和炎性介质从而干扰宿主的防御和免疫细胞功能。

一些TACY可被动或主动保护试验动物。参见FEMS Lett.182，197-205，2000。然而，这些毒素复杂的有害副作用模式将影响它们作为疫苗候选物的用途。也就是说，本领域需要无毒的SLO蛋白。

附图简述

图1.SLO的三维计算机模型。脯氨酸表示为空间填充。Pro427为白色。

图2.该图显示了用含有野生型SLO和SLO突变型P427L的大肠杆菌提取物进行的溶血试验的结果。

图3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片，显示了纯化的SLO突变型P427L。

图4.该图显示了用纯化的野生型SLO和SLO突变型P427L进行的溶血试验的结果。

图5.大肠杆菌裂解上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片。泳道A，大肠杆菌阴性对照；泳道B，rSLO野生型，无标签；泳道C，rSLO P427L，无标签；和泳道D，纯化的rSLO野生型，无标签(5mg)。

图6.该图证明，在相同条件下，SLO突变型P427L的溶血能力比野生型SLO低1000倍。

图7.该图证明了胆固醇对野生型SLO和SLO突变型P427L溶血作用的影响。

图8.细胞提取物中所有无标签蛋白的SDS-PAGE分析的显微照片。图8A，SLO野生型和P427L无标签蛋白的表达；图8B，SLO P427L+W535、P427L+C530G、和P427L+C530G+W535F无标签蛋白的表达。

图9.细胞提取物中所有带His标签的蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。

图10.纯化的带His标签的蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。

图11.纯化的无标签蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。图11A，泳道A，SLO野生型无标签蛋白；泳道B，SLO P427L无标签蛋白；分子量标记(116-66.2-45-35-25-18.4-14.4)；黑色箭头表示从突变型和野生型克隆纯化的SLO蛋白。图11B，泳道A，SLO野生型无标签蛋白(3μg)；泳道B，SLOP427L-W535F无标签蛋白(3μg)；分子量标记(116-66.2-45-35-25-18.4-14.4)；黑色箭头表示从突变型和野生型克隆纯化的SLO蛋白。

图12.纯化的无标签SLO野生型蛋白的SDS-PAGE分析的显微照片。在还原和非还原条件下分析野生型SLO不同纯化批次的样品。

图13.该图显示了带His标签的SLO突变体的溶血测试结果。

图14.该图显示了抗-SLO抗血清对SLO-诱导的溶血活性的抑制作用。

图15.该图显示了抗-SLO抗血清抑制SLO溶血作用的滴度。

图16.该图显示了SLO溶血活性滴度。

图17.该图显示了野生型SLO、化学去毒的野生型SLO和SLO突变体(P427L；P427L+W535F)的溶血活性滴度。

图18.该图显示了野生型SLO和SLO突变体(P427L；P427L+W535F)的溶血活性滴度。

图19.该图显示了野生型SLO和化学去毒的野生型SLO的溶血活性滴度。

图20.该图显示了使SLO溶血活性(50ng/ml SLO)降低50％所需的SLO突变体P427L+W535F抗血清的稀释度。

图21.该图显示了使SLO溶血活性(100ng/ml SLO)降低50％所需的SLO突变体P427L+W535F抗血清的稀释度。

图22.滴定曲线，显示了用100％溶血毒素浓度进行的溶血抑制试验。