[发明专利]用于治疗结核病的有效的新药物靶标

说明书

技术领域

本发明涉及用于鉴定治疗结核病之新药物的筛选方法，以及鉴定对这些新药物具有抗性之临床菌株的诊断方法。

背景技术

结核病(tuberculosis，TB)仍是由单一感染性病原体结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的首要死因。该病原体已潜伏性感染了三分之一的世界人口。目前，结核病化学疗法由一线和二线药物的混合剂构成。实际的结核病治疗需要6～9个月，导致严重的毒性和抗药性。从引入抗结核病药物时开始便不断出现抗药性结核分枝杆菌菌株。事实上，由于具有不寻常的细胞壁，分枝杆菌天然地对大多数常用抗生素具有抗性。此外，认为遗传学改变也使其获得抗药性。由于结核分枝杆菌菌株对越来越多的用于治疗多重抗药性结核病(multidrug-resistanttuberculosis，MDR-TB)的二线药物产生抗性，因此其已成为世界范围公共健康的威胁(1)。因而，急需治疗结核病的新药物。特别地，我们需要具有新作用机制的对抗药菌株具有活性的新药物。相应地，还存在鉴定新药物靶标的迫切需求(2)。

发明内容

本发明基于以下发现，即来自结核分枝杆菌的蛋白质Rv3790(编码该蛋白质的DNA序列可以从http://genolist.pasteur.fr/TubercuList(TubercuList万维网服务器；Rv3790基因坐标：从4162306到4163718)获得)是苯并噻嗪酮药物的靶标，苯并噻嗪酮药物是一类新的对于治疗结核病很有前景的分子(“New thiazinone derivatives，their preparations andtheir use as antibacterials”，专利申请号PCT/EP2006/004942，申请人：Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology e.V.Hans--Institute(HKI))。

已显示Rv3790和Rv3791蛋白质协同作用并且参与阿拉伯半乳聚糖生物合成(3)。阿拉伯半乳聚糖是分枝杆菌细胞壁的基本组分，其使分枝菌酸外层与肽聚糖共价结合。特别是，Rv3790和Rv3791两者对于将十聚异戊二烯磷酸核糖转化为十聚异戊二烯磷酸阿拉伯糖都很重要(3)。该发现提示，苯并噻嗪酮药物干扰分枝杆菌细胞壁的生物合成。值得注意的是，通过H37Rv菌株中基于Himar1的转座子诱变发现rv3790-rv3791两种基因必不可少(4)。

我们发现Rv3790蛋白C端的突变及其过表达赋予结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG和耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmetis)对苯并噻嗪酮衍生药物的高度抗性。rv3790野生型和突变基因以及rv3791已被克隆并在大肠杆菌中过表达。

对苯并噻嗪酮衍生物敏感的Rv3790直向同源物已在下列属中发现：诺卡氏菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)和棒状杆菌属(Corynebacterium)。

可以假定实验室评价苯并噻嗪酮衍生物得到的好结果与已发现的Rv3790抑制性作用相关。这一证据能够促使针对Rv3790蛋白作用之药物的新研究。因此，Rv3790蛋白和相关的同源物尤其是直向同源物不仅是苯并噻嗪酮类药物的最佳靶标，而且是发现可用于对抗由结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、诺卡氏菌、红球菌和棒状杆菌引起之感染的新药物的有前景靶标。

因此，本发明的一个目的是提供通过干扰阿拉伯半乳聚糖生物合成来治疗结核病之候选药物的筛选方法，所述方法包括如下步骤：将过表达使十聚异戊二烯磷酸核糖转化为十聚异戊二烯磷酸阿拉伯糖之蛋白质的结核分枝杆菌细胞培养物与候选药物相接触，所述蛋白质可由rv3790基因或其同源物或者其基因产物与Rv3790蛋白相同或同源之任意人工开放读码框所编码，然后评价在测定试验中由候选药物所引起的相比于对照(仅用pSODIT-2载体转化的结核分枝杆菌)的抑制百分数。

优选地，所述测定试验是抗细菌活性的体外测定试验或酶促试验。

本发明的另一目的是结核分枝杆菌突变株(第387位的氨基酸半胱氨酸被丝氨酸或甘氨酸替换)的细胞培养制备物，其用作本发明方法中的对照工具。

本发明的另一目的是制备用于酶活性测定和鉴定新药物之筛选方法的野生型和突变型重组Rv3790蛋白。