[发明专利]生产有机酸的方法和过程

说明书

本发明总地涉及生产有机酸的方法，更具体地，涉及通过使用源自代谢和过程工程化的耐酸性厌氧细菌菌株的发酵来生产丁酸、丙酸和醋酸的方法。

对矿物燃料将来的缺乏、成本和环境影响的关注激发了开发廉价的、可再生的作为燃料和化学制品替代来源的生物质的兴趣。因为原油价格上涨，基于生物的化学制品和工业产品成为有吸引力的石油衍生对应物的替代品。使用厌氧微生物的发酵方法提供了有前景的将生物质和农业废物转化成化学制品和燃料的途径。存在大量需要适当处置以避免污染问题的低价值农产品和食品加工副产物/废物。这些生物质废物原料可以用作低价给料，用于生产燃料和化学制品，如有机酸。

因为基于石油原料与日俱增的成本、对石化工业引起的环境污染的公众关注以及消费者对食品、化妆品和药品中基于生物的天然成分的偏好，从可再生来源生产丁酸和氢已经成为基于石油加工方法的吸引力日增的替换方案。丁酸是通过梭菌属物种，如酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、丙酮丁酸梭菌(C.acetobutyricum)、波氏梭菌(C.populeti)和热醋梭菌(C.thermobutyricum)，从糖产生的短链脂肪酸。尽管丁酸目前主要是通过石化途径来生产的，但对通过发酵从天然来源生产丁酸存在着日益增加的兴趣。然而，因为产丁酸细菌是异型发酵的并受到丁酸的强烈抑制，因此用于丁酸生产的常规发酵技术受到反应器生产力低、产物浓度低和产量低的限制。

相似地，常规丙酸发酵方法遇到生产力低、产量低以及终产物浓度低和纯度低的问题，并且对于商业应用是不经济的。丙酸是广泛用于纤维素塑料、除草剂和香料生产中的重要化学制品。丙酸也是重要的霉菌抑制剂。它的铵盐、钙盐、钠盐和钾盐广泛用作食品和饲料防腐剂。目前，大部分商业销售的丙酸是通过石油化学方法生产的。然而，对通过丙酸细菌从糖的发酵生产丙酸存在着越来越大的兴趣。尽管通过各种方法和菌株改良在提高发酵生产力和终产物浓度中存在着一些成功，但怎样进一步提高发酵过程中的丙酸产量和纯度仍然是个挑战。

经济上可行的用于化学制品生产的发酵方法的研发需要不仅具有高生产率而且可以耐受高浓度发酵产物的微生物。改进工业微生物的方法包括经典菌株改良(CSI)的随机方法和代谢工程化的高度理性方法。尽管CSI是很有效的，但其是时间和资源密集性的。为了获得对抑制性发酵产物高耐受性的菌株，通常使用通过在递增抑制剂浓度的培养基中连续培养，并结合通过化学诱变剂或UV照射来诱导突变来连续筛选和选择突变株。然而，常规培养筛选方法是繁重、费时的，且常常没有结果。最近，也已经应用重组DNA技术来改善对抑制性产物的细胞耐受性。这些方法通常更有效，但使用也更复杂并需要遗传水平的详细抑制机理的知识，这对于具有工业发酵关注的大部分微生物而言是不可获得的。

代谢工程化广泛用于设计工程化菌株，以通过代谢量分布的改变来获得较高效率的代谢产物过度产生。迄今为止，大多数代谢工程化工作涉及使用遗传学和生理学得到了充分研究的微生物(例如，大肠杆菌、酵母和杂交瘤细胞)次生代谢产物(如抗生素)、氨基酸(例如，赖氨酸)和异源蛋白质的产生。代谢量分布的化学计量分析给代谢工程化、最佳的培养基配方和给料策略以及生物方法优化提供了指导，然而，这些需要对发酵细胞中的代谢和调控网络的深入了解。尽管理性代谢工程化方法在涉及基因簇内的单个基因或少数几个基因的情况下已经成功，但在涉及复杂或代谢途径很大程度上未知的许多情况下，是无效的。这是因为理性代谢工程化方法通常一次针对一个基因，因此不能预测途径中多个基因间复杂的相互作用。

丙酸细菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性、不产生孢子、非运动性、兼性厌氧、棒状的细菌。丙酸细菌属的成员广泛用于维生素B₁₂、四吡咯化合物和丙酸的生产中，已经用于益生菌和干酪工业中。如图1中所示，通过丙酸细菌从二羧酸途径生产丙酸，并且通常伴随醋酸盐和二氧化碳的形成。理论上，通过EMP(Embden-Meyerhof-Parnas)途径进行糖酵解时，1mol葡萄糖只产生4/3mol丙酸盐和2/3mol醋酸盐。当存在明显的细胞生长和生物质形成时，试剂的丙酸盐产量要低得多。即使在10g/L相对低的浓度下，丙酸盐也是发酵的强抑制剂。典型的分批丙酸发酵需要～3天来达到～20g/L丙酸，丙酸产量通常低于0.4g/g葡萄糖。就产量、终产物浓度和生产速率而改善丙酸发酵的尝试导致了新的生物方法和突变菌株的产生，但成功有限。需要发酵方法的显著改进，以使得基于生物的丙酸在经济上与其石油对应物和其他相关化学制品可相互竞争。