[发明专利]用于在昆虫细胞中外源蛋白质表达的昆虫衍生启动子

说明书

技术领域

本发明可以涉及生物技术领域。本发明涉及源自昆虫中hexamerin家族基因的调控多核苷酸序列(如启动子)，和它们用于在昆虫细胞和昆虫幼虫中外源蛋白质表达的用途，例如使用杆状病毒表达载体。

背景技术

杆状病毒-昆虫细胞表达系统是通用的和广泛地用来产生异源的(天然的和重组)蛋白质。这个系统被普遍地接受作为最强的和通用的系统之一以生产任何尺寸的重组蛋白质。它基于两个主要的特性：获得高含量的蛋白质表达和恰当的蛋白质折叠以变得生物活性，同时出现哺乳动物细胞的重要的翻译后修饰。另外，这个系统的开发时间较短，重组病毒的遗传稳定性非常高。杆状病毒基因组包含两个强的启动子，称为多角体蛋白启动子(pL)和启动子p10(p10蛋白质)，其中多角体蛋白启动子(pL)是高等生物中已知的最强启动子。pL启动子可用于控制几乎任何基因的表达。与基于转化动物细胞或转基因动物的任何其他先进生产系统相比，更快速和更便宜地设计杆状病毒用于蛋白质生产。尽管如此，先前的市售可得的启动子具有一些缺点，如它们促进基因表达的时期非常晚。那时，细胞机制被大大影响，并且随后在昆虫细胞中表达的异源蛋白质的产率可能被影响，由于不完全的加工和聚集。这些限制可以是由于寄主细胞因子随着病毒感染进行而恶化。为了解决那样问题，本发明建议使用具有稳定的表达的早期启动子，其至少与多角体蛋白启动子一样强，作为非常令人感兴趣的选择以抵消寄主细胞分解的影响，同时获得异源蛋白质的高表达水平。本发明希望强调这样的事实：幼虫(不成熟的)向成虫(成熟)形式的转变是通过在各种组织(昆虫变形发育)中激活和抑制许多基因实现的。在变形相关蛋白质中，存在被称为hexamerin的家族，其在最后的龄虫期间以非常高的水平表达。这些蛋白质主要是血淋巴储存蛋白质，其在后幼虫发育期间被使用。在五龄期的最初48小时期间能够观察到hexamerin的最高水平，其为该时期后的大约4倍(图1)。在本发明中已经开发了用于外源蛋白质表达的启动子家族，其脱离了编码上述幼虫蛋白质家族的序列。因此，本发明提供了启动子pB1(SEQ ID NO：1)和pB2(SEQ ID NO：2)，其与现有技术中使用的启动子相比更早期和更强。在本发明中已经分离了在特定的进展幼虫阶段驱动重要昆虫蛋白质表达的启动子。它们来自编码幼虫中蛋白质hexamerin的序列，并且可以用于构造任何表达载体(如杆状病毒表达载体)以便在多种昆虫细胞中表达异源蛋白质，优选来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的sf9或sf21细胞。与构成这些新的启动子类似的调节序列已经在鳞翅目幼虫中被鉴定，但之前还未曾用于杆状病毒表达系统。

发明内容

简要说明

由此，本发明提供了来自调节hexamerin家族基因表达的序列的调控多核苷酸序列，如pB1(SEQ ID NO 1)和/或pB2(SEQ ID NO 2)。这些蛋白质在五龄期期间显示出最高的表达，在该幼虫发育期的最初48小时候以非常高的百分比，呈现出在短时期内非常快速的积聚(图1)。这些特征暗示这些蛋白质的表达是由强的启动子驱动的，这些启动子可用于形成更有效率的杆状病毒或任何其它表达载体，并且因此用于优化异源蛋白质的表达。在杆状病毒表达系统情况下，一旦蛋白质集中在分泌途径中，则启动子的早期活性是特别相关的，如果其他方式的话，则会受到细胞翻译后机制和分泌机制在杆状病毒感染的非常晚期改变的影响。

本发明的启动子的序列来自调节hexamerin家族基因(BJHSPl和BJHSP2)表达的序列，但是具有一些不包含在所述hexamerin家族基因原始调控核苷酸序列中的突变。所述·分离自粉纹夜蛾(Trichoplusiani)(T.ni)幼虫并通过质谱分析鉴定为在80KDa的带中(图2)。一旦蛋白质被鉴定，则分离编码它们的基因以及包含它们的各自启动子的上游序列。用于扩增各原始的启动子的引物在该专利中被指定。特征为SEQ ID NO：3和4的引物用于扩增原始的启动子，其最终起源于启动子pB1(SEQ ID NO：1)。特征为SEQ ID NO：3和4的引物5和6的引物用于扩增原始的启动子，其最终起源于启动子pB2。

本发明的启动子的主要优点，具体地pB2，是这样的启动子，与现在在杆状病毒表达系统中使用的已知的非常晚期启动子相比，它们产生更早和更强的目标蛋白质的表达。