[发明专利]一种耐热非-K12大肠杆菌植酸酶及其生产

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、生物化学、及植酸酶的发酵和后加工等领域。更确切的说，本发明涉及一种新的非-K12大肠杆菌基因编码的耐热植酸酶的克隆和表达。

技术背景

植酸酶(肌型肌醇-六磷酸盐磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)是一种能够将植酸(肌型肌醇-六磷酸盐)水解为肌醇和无机磷的酶。众所周知植酸酶是很有价值的饲料添加剂。20世纪末，植酸酶作为动物饲料添加剂的年销售额估计超过一亿五千万美元，并且还在逐步增加。

目前，禽、猪日粮以谷类、豆类和油籽产品为主。这些饲料中所含有的磷约有三分之二以植酸和植酸盐的形式存在。植物中的植酸磷是钙-镁-钾植酸盐的混合物，其以螯合物的形式存在，溶解度很低。这种形式的磷很难被人、猪、禽等单胃动物所消化。

使用植酸酶水解植酸中键合磷基团的酯键，可以提高植酸磷以及结合在植酸复合物中的矿物质和微量元素的利用率。植酸酶是一种特殊的磷酸酶，其能够水解植酸成为一系列肌醇和磷酸盐的低磷酸酯。已知的植酸酶有两种类型：3-植酸酶和6-植酸酶，以其首先易于攻击的磷酸酯键的位置作为区别。虽然单胃动物缺乏能有效利用植酸磷的足够的植酸酶，但是很多真菌、细菌和酵母能生产植酸酶，并可用于对动物口粮进行补充。

补充植酸酶能够有效提高磷消化率，这已经在动物实验中得到了很好的证明(Mroz et al.，1994；Kornegay et al.，1996；Rao et al.，1999；Ravindran et al.，1999)。所使用的酶的功效，不仅取决于酶的类型、反应速率和存在的酶活力水平，还取决于酶在通过胃肠道时所遇到的不同环境中，以及在食品或饲料制剂预处理时所采用的条件下保持其活性的能力。

虽然有众多的植酸酶可用于添加剂，但是很多酶都存在一定的缺陷。例如，许多目前使用的植酸酶在饲料造粒过程中由于热处理会丧失其活性。另外，许多目前使用的植酸酶对动物消化系统中的胃蛋白酶和胰蛋白酶等没有足够的抗性。

因此，迫切需要可用于动物饲料和食品加工的优良性质的植酸酶产品。

发明概述

一方面，本发明提供一个分离的核酸分子，其包含一个选自以下组中的核酸序列：

a)一个核酸序列所编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

b)一个在严格的杂交条件下与a)中的序列所杂交的核酸序列，其所述核酸序列编码有非-K12大肠杆菌植酸酶活性的多肽；或

c)一个与a)或b)中的序列互补的核酸序列；

在本发明的一个实施例中，所分离的核酸分子含有一个选自以下组中的核酸序列：

a)一个核酸序列，其组成核苷酸67-1296如SEQ ID NO：1所示；

b)一个核酸序列，其组成核苷酸1-1230如SEQ ID NO：2所示；

c)一个如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

d)一个在严格条件下与a)到c)中任一个所杂交的核酸序列，其编码有非-K12大肠杆菌植酸酶活性的多肽；或

e)一个与a)到d)中任一个所互补的核酸序列。

另一方面，本发明提供一个载体，其包含本发明所分离的核酸分子，优选的，所述的载体是一个表达载体。例如，所述载体可以选自下组中：pTrcHis2-PhE，pPIC9K-PhE，pMET-PhE和pKLAC-PhE。

另一方面，本发明提供一个分离的细胞，其包含本发明中所述的分离的核酸分子，优选的，所述的分离的核酸分子是一个组成的表达载体。优选的，所述的细胞是酵母细胞。例如，所述的细胞可以选择大肠杆菌(Escherichia coli.)，毕氏酵母(Pichia pastoris)，甲醇酵母(Pichia methanolica)和克鲁维乳酸酵母(Kluyeromyces lactis)。更具体的说，所述细胞可以选择E.coli MG1655，P.pastoris GS115，P.methanolica PMAD16和Kluyeromyces lactis GG799。在本发明的一个实施例中，所选择的细胞包括：转化有重组质粒pTrcHis2-PhE的E.coli MG1655，转化有重组质粒pPIC9K-PhE的P.pastoris SMD1168，转化有重组质粒pMET-PhE的P.methanolica PMD16和转化有重组质粒pKLAC-PhE的Kluyeromyces lactis GG799。

另一方面，本发明提供一个多肽，其包含一个选自以下组中的氨基酸序列：

a)一个如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或