[发明专利]样品中抗原响应细胞的检测

说明书

说明

本发明涉及利用多维标记抗原呈递化合物，例如主要组织相容性复合抗体(MHC)以检测样品中抗原响应细胞的方法。此外，本发明涉及利用该多维标记抗原呈递化合物，例如抗原-主要组织相容性复合抗体(MHC)在样品，优选单一样品，例如血液样品中抗原响应细胞的检测中的应用。本发明的方法能实现特定抗原响应细胞，例如T和B细胞的高通量分析，从而提供了，例如疾病或病症的监控以及免疫治疗、疫苗的研发、或表位或免疫原性氨基酸序列的鉴别的高通量方法。

抗原响应细胞，例如T和B细胞，能通过利用其克隆特异性(clone-specific)T细胞受体(TCR)监控疾病特异性肽-主要组织相容性复合抗体(MHC)来鉴别病毒感染的细胞和肿瘤细胞等。人T细胞的组合所表达的不同TCR的库非常大，估计达约2500万(Arstila等，1999)。

为了疾病和病症的监控和免疫治疗或疫苗的开发，能够从大量无关抗原响应细胞、即不含有抗原特异性受体的细胞库中，检测、鉴别或分离出那些鉴别，例如克隆特异性T细胞受体(TCR)、特异性抗原-MHC(aMHC)复合物例如肽-MHC(pMHC)的特异性抗原响应细胞例如T细胞和B细胞是很关键的。

如最早由Altman等(1996)所示，偶联了荧光团的可溶性多聚体pMHC复合物可用于通过流式细胞术检测抗原特异性T细胞。这些荧光MHC多聚体的使用已经成为研究和临床监控中T细胞监控的基石。

然而，单个生物样品中仅可监控几个(且经常仅一个)抗原的特异性这一事实成为使用MHC多聚体流式细胞术检测抗原特异性T细胞应答中的主要限制。这一限制是由于“通道”，即可通过其激发或发射光谱区分或用流速细胞术检测的不同标记例如荧光团的数量的限制，且这严重限制了一般能得到的有限量生物材料(例如单份外周血样品)中可进行的T细胞应答分析的数量。

例如，生物材料被分析以监控自然产生(例如在感染或癌症后发生)的免疫应答。此外，生物材料被分析以得到免疫治疗(包括疫苗)对免疫应答的影响。本文所用免疫治疗是定义为旨在增强或抑制免疫应答的医疗介入，包括疫苗、非特异性免疫刺激剂、免疫抑制剂、基于细胞的免疫抑制、基于细胞的免疫治疗及其组合中的活性成分。

尽管最近的量子点(Qdots)作为新型无机荧光团的开发、和流式细胞设备的多参数检测可能性的持续增加，通过pMHC多聚体染色在单一样品中能分析的不同T细胞集合的最大数量仍为4种(Chattopadhyay等，2006)。

由多个研究组已经尝试开发称为MHC微阵列技术这一事实可以理解对于开发能进行更全面的抗原特异性T细胞应答分析技术的需求。在这些系统中，T细胞特异性不是由荧光团编码的，而是由空间编码的(Soen等，2003；和Stone等，2005)。尽管具有潜力，MHC微阵列还未被广泛采用，也未有文献实例证明其在T细胞响应的多重检测(例如表位鉴别)中的价值。

组合编码系统已在多种设定下用于增加单一样品中可进行的分析的数量。在Qdots领域的一个具体例子是由使用Qdot编码的微珠进行基因分型而形成的(Xu等，2003)。此外，组合编码用于利用珠阵列测量血清产物例如细胞因子，其中编码通过不同的珠粒尺寸，荧光团和荧光团强度进行(例如，BD细胞术珠阵列)。所有这些例子中，溶质通过结合到预编码的微珠上进行分析。

考虑上述信息，本领域仍然需要能够以高通量方式检测、分离和/或鉴别特异性抗原响应细胞，例如抗原特异性T细胞的方法。

此外，考虑到可得的样品量通常很有限，本领域还需要能够在单个样品中检测、分离和/或鉴别多种特异性抗原响应细胞，例如T细胞的方法。

因此，本发明的目的包括，提供在相对少量的生物样品，例如单个样品，例如单个外周血样品中检测多种抗原特异性细胞的方法，优选以高通量的方式。

该目标和其它目标通过所附权利要求1定义的方法实现。

具体而言，该目标通过在样品(生物材料如外周血样品)中检测抗原响应细胞的方法实现，该方法包括：

-提供(例如加载)携带至少一种标记的抗原呈递化合物，和两种或两种以上预定抗原，其中各抗原由至少两种不同标记表示(编码)；

-将所述含有抗原的抗原呈递化合物与所述样品接触；

-检测所述加载抗原的抗原呈递化合物与所述抗原响应细胞的结合，从而检测对所述抗原的细胞响应；

其中通过检测由加载有所述抗原的所述抗原呈递化合物而结合在抗原响应细胞上的至少两种不同标记的存在来检测所述抗原。