[发明专利]琥珀酰二胺的制备方法及其抗菌活性的用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种从细菌发酵液中分离提取得到的琥珀酰二胺(Succinamide conjugatediacid，SCD)的制备方法，及其在抗某些细菌方面的用途。

背景技术

抗生素已经成功用于预防和治疗由于微生物引起的感染。到目前为止，已经有几千种抗生素用于临床。由于抗生素的大量广泛使用，抗生素带来的副作用及微生物对抗生素的抗药性日益突出。如耐药性特强的绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌以及结核杆菌几乎对现有的所有抗生素都产生了耐药性，导致近年来有很多人都死于这些耐药性细菌的攻击。因此，寻找新的抗菌药物如抗生素具有重要的实际意义。

微生物是抗生素等抗菌药物的主要的生物来源，是最具开发前景的资源。但由于最近几十年的不断寻找，新抗菌药物如抗生素的发现越来越难。

极端环境微生物包括冷适应微生物(噬冷菌、耐冷菌)、噬热菌、嗜酸菌和嗜碱菌等。这些微生物生活在极端的环境中，每类微生物具有独特的特征，是非常丰富的微生物资源。如有种嗜热的假单胞菌(Pseudomonas)可产生一种铁结合化合物(pyochelin)，可抑制一些假丝酵母和一些曲霉的生长。冷适应微生物生活在冷环境中，地球上冷环境非常丰富，如海洋、两极地区、高山地区等，冷适应微生物是个非常巨大并且尚未被充分开发和利用的资源。已经有科学家从海洋冷适应微生物中发现了一些新的化合物。因此，冷适应微生物在分离新化合物方面具有很大的潜力。

海洋是地球上最大的冷环境，冷适应微生物资源非常丰富。海洋冷适应微生物具有独特的生理机制适应低温环境，从中寻找新的抗菌物质具有很大的前景。海洋微生物及其代谢产物的活性成分具有化学结构的多样性、生物活性的多样性、高生物活性、特殊作用机制等一些非常值得注意的特点。国外在上世纪四十年代就开始了海洋微生物抗生物质的研究，50年前从海洋生物中发现并研制成功了第一个新抗生素头孢菌素开创了开发海洋新抗生素的先河。我们的思路是，从海洋冷适应微生物这个巨大的宝库中分离筛选新的抗菌药物，满足对新抗菌药物的需求。

发明内容

本发明的目的之一是提供琥珀酰二胺(Succinamide conjugate diacid，SCD)的制备方法，及其在抗某些细菌方面的用途。本发明涉及从一株不动杆菌属的细菌菌株(Acinetobacter sp.)中分离提取得到琥珀酰二胺(化学结构如式1)的制备方法及在抗某些细菌方面的用途。

式1：琥珀酰二胺化学结构式

1、SCD的制备方法如下：

(1)供试菌株及菌悬液的制备

实验菌株(Acinetobacter sp.)系本实验室从海水样品中分离，为革兰氏阴性短杆菌，通过形态学及16S rDNA序列(Genebank上申请的序列号为DQ189256)分析表明属于不动杆菌属(Acinetobacter)。从-20℃保藏的菌种中取少量菌种接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于15℃进行震荡培养(200rpm，48h)进行活化，用显微计数法记数，用无菌0.8％NaCL溶液将菌悬液浓度调整为10⁶～10⁷cell/mL。

(2)SCD的发酵生产

取上述活化好的细菌悬液接种到含有PDA液体培养基中，接种量为1％，置于15～20℃进行恒温通气发酵，通空气量0.5～1.0vvm，发酵3～5天，培养至活性物质浓度最大(72h)。

(3)SCD的分离

抗菌物质的分离大致经过以下几个步骤：A)将发酵液于4℃进行离心(15min，8000rpm)，收集上清液，并将上清进行减压浓缩。B)将浓缩后的上清液用分液漏斗进行萃取，所用的有机溶剂为EtOAc(乙酸乙酯)和n-BuOH(正丁醇)。C)将萃取产物回收，过硅胶层析柱，洗脱液为丙酮在石油醚中的浓度梯度(0～50％)，50mL为一流分。D)将流分蒸发致干，点到硅胶板上，用石油醚：乙酸乙酯为3:1进行展开。把相同的Rf值的样品合并在一起，最后用丙酮重结晶，得到式1所示的琥珀酰二胺纯品。

2、SCD对几种细菌的抑制作用及MIC(最低抑菌浓度)测定

(1)抑菌试验