[发明专利]一种检测人乳头瘤病毒中和抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及人乳头瘤病毒抗体检测领域。更具体地，本发明涉及通过联合应用带有报告基因的人乳头瘤病毒假病毒和自动扫描仪器，对人乳头瘤病毒中和抗体进行检测的方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)感染的流行范围广，所引发的相关致死性的恶性肿瘤和多种性传播疾病对人类健康具有严重的危害性，开发安全有效的预防或治疗性疫苗具有重大意义。针对HPV的中和抗体水平是HPV疫苗研究开发的关键性指标，因此建立高效、准确和便捷的中和抗体检测方法十分重要。然而，由于HPV具有严格的宿主特异性，同时其病毒复制与宿主细胞的分化状态密切相关，目前难于在体外对HPV进行快速高效的组织培养，也缺乏适宜的动物模型。因此探索建立可及时快速鉴定或筛选中和抗体和评估待选疫苗保护性的方法是十分必要的。

目前，已发展出多种不同类型的HPV中和抗体评估方法，如基于免疫缺陷小鼠组织移植模型的评估方法(White WI等，病毒学杂志，1998年，72卷：959-964页)、基于体外感染原代上皮组织的评估方法(Meyers C等，科学，1992年，257卷：971-973页)、基于HPV类病毒颗粒(VLP)的ELISA方法(1999年，Semin Cancer Biol)以及血凝抑制实验(Roden RB等，病毒学杂志，1996年，70卷：3298-3301页)等，但这些方法分别存在操作复杂、效率低、实验周期长或不能准确反映抗体的中和保护作用等问题。因此，迫切需要发展能够便捷、有效地检测HPV中和抗体的方法，同时希望新方法能够适合于进行高通量的检测。近来，研究显示HPV VLP具有可非特异性包裹质粒核酸的特点，因此可构建携带报告质粒的HPV假病毒(HPVpseudovirus)用于体外有效模拟HPV感染过程，并可用于对HPV中和抗体进行快速检测(Buck CB等，病毒学杂志，2004年，78卷：751-757页)。基于HPV假病毒的中和抗体检测方法相比其它传统方法具有较为明显的简便、效率高的优点，实验周期缩短，对于不同的HPV亚型具有较好的通用性。目前，基于HPV假病毒的中和抗体检测方法已得到日益广泛的应用。

然而随着研究的深入，对HPV中和抗体检测提出了更高的要求，除了灵敏度和准确度好外，同时要求能够更为快速、简便，能够更准确地进行客观的量化检测以提高重复性。当前基于HPV假病毒的中和抗体检测方法，主要有2种：(1)以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，构建带有GFP报告基因表达元件的HPV假病毒，在感染293TT细胞后用荧光显微镜目测或流式细胞仪(FACS)检测发绿色荧光的细胞(被感染细胞)，通过检测HPV中和抗体对假病毒感染的阻断能力评估其效价；(2)以分泌型碱性磷酸酶(SEAP)为报告基因，构建带有SEAP报告基因表达元件的HPV假病毒，感染293TT细胞后通过离心收集细胞培养上清，之后通过SEAP化学发光检测试剂盒进行显色，再用化学发光酶标仪获得结果，通过检测HPV中和抗体对假病毒感染的阻断能力评估其效价。在应用中发现，上述第一种方法的操作较为复杂耗时，需要进行细胞消化操作，然后逐孔用FACS进行检测，1个96孔板的检测过程通常需要2至3个小时，耗时费力；第二种方法的操作可使用类似酶标仪的仪器进行快速扫描判定，有利于批量检测，但其试剂盒成本较高，其主要检测酶促显色反应程度，同时这种方法存在灵酶度的问题，细胞在被少量感染时SEAP分泌量低就会存在读值的阳性/阴性值比(P/N比)低的问题，会影响结果判定。因此为了提高P/N比，就需要使用更大量的假病毒，不利于提高实验效率。

本发明建立了一种简单、准确而又高灵敏度的HPV中和抗体检测方法，可更好地满足对HPV中和抗体检测实验的要求。

发明概述

本发明的目的是建立简便、有效、高灵酶度的，并且能够更适合于进行高通量检测的HPV中和抗体检测方法。本发明在检测中引入了具有快速扫描检测能力的斑点检测仪器，采用斑点检测法检测被HPV或HPV假病毒感染的细胞，同时相应采用了可使被感染细胞产生颜色标记信号以适于应用斑点检测仪器进行检测的报告基因，从而组合建立了一种新型高效的HPV中和抗体检测模式，并将这种模式应用于HPV中和抗体的检测方法，可用于检测不同亚型HPV的中和抗体。