[发明专利]一种利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法。

背景技术

胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)是借助显微操作技术从体外受精得到的胚胎中取出1-2个分裂球或极体进行遗传学检查，选出遗传性状正常的胚胎送回母体子宫。

PGD主要采用荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization，简称FISH)，用荧光标记的DNA探针结合到卵裂球特异的DNA靶序列上，通过采用不同的荧光标记探针，可以同时分析单一细胞多个染色体情况。从首例将FISH方法应用到PGD上以来，该方法进行了很多改进。目前PGD采用的FISH技术需先将卵裂球进行低渗破膜处理，去除胞浆成分，然后再进行固定，原位杂交等一系列步骤。这种方法存在如下缺点：由于去除了胞浆成分，实验结果与染色体的实际位置有偏差；需要实验人员娴熟的操作技能；可能导致一定比例的卵裂球丢失和无信号。在PGD诊断中，因为每个病人只有少量的胚胎，而且每个胚胎只能取1-2个卵裂球进行分析，每一枚卵裂球提供的信息都非常重要。这就需要研究者们不断改进FISH操作的步骤，在获得清晰信号的前提下尽量减少样本丢失率。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法。

本发明提供的利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法，是在体积为50微升以下的液滴环境中进行三维荧光原位杂交。

所述方法具体包括如下步骤：

1)用多聚甲醛对单卵裂球进行固定；

2)将固定后的单卵裂球进行透膜处理；

3)将透膜处理后的单卵裂球进行去蛋白处理；

4)将去蛋白处理后的单卵裂球与探针进行杂交。

所述步骤1)中，将单卵裂球在10微升-50微升的液滴A中进行固定；所述液滴A中可含有体积百分含量为2％-4％的多聚甲醛。

所述步骤2)中的透膜处理可包括如下步骤：将单卵裂球依次置于10微升-50微升的液滴B、10微升-50微升的液滴C中进行处理；然后将单卵裂球在液氮中进行冻融；所述液滴B中含有体积百分含量为0.4％-1.0％的TritonX-100；所述液滴C中含有体积百分含量为15％-25％的甘油。

所述述步骤3)中的去蛋白处理可包括如下步骤：将单卵裂球置于10微升-50微升的液滴D中进行处理；所述液滴D含有浓度为0.08-0.12M的HCl。

所述步骤3)还可包括将单卵裂球置于液滴D中处理后，再在液滴D中加入甘油的步骤。

所述步骤4)中探针的用量可为0.05-0.08微升。

所述方法在步骤4)后，还可包括将杂交后的单卵裂球在10微升-50微升的液滴环境中进行洗脱的步骤。

所述洗脱具体可为如下a)或b)的操作：

a)不移动单卵裂球，缓慢吸弃洗脱液再加入另外一种洗脱液进行洗脱；

b)在洗脱液中加入0.08％-0.12％NP-40/2*SSC，移动单卵裂球进行洗脱。

所述0.08％-0.12％NP-40/2*SSC是含有体积百分含量为0.08％-0.12％的NP-40的2*SSC。

所述方法在单卵裂球遗传检测中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供的方法既可以应用于临床医学领域也可以应用于科研领域。