[发明专利]具有增加的2-酮基-D-葡萄糖酸累积的代谢工程细菌株

权利要求书

1.增加细菌宿主细胞中2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)累积的方法，包括：

a)在细菌宿主细胞中失活至少一个内源性基因，以得到改变的细菌细胞，在碳源存在下，所述细菌宿主细胞能够从2-KDG的酶促转变产生2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-DKG)，所述内源性基因是2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-KDGDH)活性所需的；和

b)在合适的培养条件下培养改变的细菌细胞，产生2-KDG。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括回收2-KDG的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括转变2-KDG为异抗坏血酸的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其中细菌宿主细胞选自欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、醋杆菌属(Acetobacter)、假单胞菌属Pseudomonas)、克雷伯菌属(Klebsiella)、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)、泛菌属(Pantoea)、杆菌属(Bacillus)和埃希氏菌属(Escherichia)细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中细菌宿主细胞是泛菌属细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个内源性基因编码具有脱氢酶活性的蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其中具有脱氢酶活性的蛋白具有SEQ ID NO：4序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其中2-KDGDH由三个亚基组成。

9.根据权利要求1所述的方法得到的改变的细菌细胞。

10.在细菌宿主细胞中累积2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)的方法，包括：

a)在细菌宿主细胞中失活操纵子，得到改变的细菌细胞，在葡萄糖存在下，所述细菌宿主细胞能够从2-KDG的酶促转变产生2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-DKG)，所述操纵子编码2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-KDGDH)，其中操纵子包括脱氢酶基因和细胞色素c基因；

b)在合适的培养条件下培养改变的细菌细胞，产生2-KDG；和

c)使2-KDG在改变的细菌细胞中累积。

11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括回收累积的2-KDG。

12.根据权利要求10所述的方法得到的改变的细菌细胞。

13.权利要求12所述的改变的细菌细胞，是欧文氏菌属细胞、克雷伯菌属细胞、泛菌属细胞或埃希氏菌属细胞。

14.根据权利要求10所述的方法，其中脱氢酶基因编码具有SEQID NO：4氨基酸序列的蛋白。

15.根据权利要求10所述的方法，其中细胞色素c基因编码这样的蛋白，所述蛋白具有与SEQ ID NO：6至少95％序列同一性的氨基酸序列。

16.能够从碳源产生2-酮基-D-葡萄糖酸的改变的细菌细胞，其经过遗传工程改造为包括无功能的2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-KDGDH)。

17.权利要求16所述的改变的细菌细胞，其中2-KDGDH酶由三个亚基组成，并且至少一个具有脱氢酶活性的亚基被失活。

18.权利要求16所述的改变的细菌细胞，其中细菌细胞选自欧文氏菌属、肠杆菌属、棒状杆菌属、醋杆菌属、假单胞菌属、克雷伯菌属、葡萄糖杆菌属、泛菌属、杆菌属和埃希氏菌属细胞。

19.权利要求18所述的改变的细菌细胞，其中细菌细胞是泛菌属细胞。

20.增加细菌培养物中2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)可利用性的方法，包括：

a)在细菌宿主细胞中失活操纵子，以得到改变的细菌细胞，在葡萄糖存在下，所述细菌宿主细胞能够从2-KDG的酶促转变产生2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-DKG)，所述操纵子编码2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-KDGDH)，其中操纵子包括脱氢酶基因和细胞色素c基因；

b)在合适的培养条件下培养改变的细菌细胞，产生2-KDG。

21.根据权利要求20所述的方法，其中2-KDG是从细菌细胞培养物中回收的。

22.根据权利要求20所述的方法，其中2-KDG被转变为异抗坏血酸。