[发明专利]具有增加的2-酮基-D-葡萄糖酸累积的代谢工程细菌株

说明书

本申请是分案申请，原申请的申请日为2004年7月27日、申请号为200480021982.7(PCT/US2004/024203)、发明名称为“具有增加的2-酮基-D-葡萄糖酸累积的代谢工程细菌株”。

1.发明背景

本发明涉及通过失活内源性膜结合2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))而改变细菌宿主细胞以积累2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid(2-KDG))的方法，2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶在失活之前催化2-KDG转化为2，5-二酮基葡萄糖酸(2，5-diketogluconate(2，5-DKG))。本发明具体地涉及增强2-DKG在泛菌属(Pantoea)菌株中生物合成地积累2-KDG和如此产生的2-KDG的用途。

商业上所需的许多产品，如L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)的中间产物，已经在遗传工程宿主细胞中生物催化地产生。尽管在许多情形下，生物转化(bioconversion)的期望终产物可以是L-抗坏血酸(ASA，维生素C)，但是ASA中间产物存在独立的用途，并且这些ASA中间产物可以是生物转化的期望产物。

用于生物催化地将普通代谢物如葡萄糖转变为ASA中间产物的一个方法显示于图1。通过氧化步骤，葡萄糖被转变为2-KDG和2，5-DKG(USP 3,790,444)。也参照产生ASA中间产物2-酮基-L-葡萄糖酸(2-KLG)的生物转化方法，其公开于Lazarus等人(1989，″Vitamin C：Bioconversion via a Recombinant DNA Approach″，GENETICS ANDMOLECULAR BIOLOGY OF INDUSTRIAL MICROORGANISMS，American Society for Microbiology，Washington D.C.由C.L.Hershberger编辑)。碳源向2-KLG的这种生物转化(bioconversion)涉及各种中间产物，并且，酶促过程和辅助因子(cofactor)依赖的2，5-DKG还原酶活性(2，5-DKG reductase(DKGR))相关。此外，已经应用重组DNA技术，在草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)中以单一的发酵步骤(singlefermentative step)，将葡萄糖生物转化为2-KLG(Anderson，S.等人，(1985)Science 230：144-149)。

在此申请中，发明人关注于，增加ASA中间产物2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)在细菌宿主中的积累。优选地，能够通过内源性膜结合2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))的酶活性、将2-KDG转化为2，5-DKG的细菌宿主细胞以失活2-KDGDH酶的方式被改变。

然后，可以将本发明包括的改变的细菌宿主中累积的2-KDG，用于各种工业和商业用途。例如，可以将2-KDG用于溶解磷酸盐或作为除草剂化合物(herbicidal compounds)合成中的中间产物，如USP3,981,860中描述的那些。此外，可以将2-KDG进一步转化为所需的终产物，如异抗坏血酸(erythorbic acid)。异抗坏血酸是ASA的立体异构体，也被称为D-异抗坏血酸(D-araboascorbic acid)。根据Reichstein和Grussner(1934)Helv.Chim.Acta 17：311-328的方法，可以化学地合成此化合物。异抗坏血酸是公知的食品添加剂、防腐剂和抗氧化剂，并且被用于工业用途和特种化学品应用中。

2.发明概述

本发明涉及，通过在碳源如葡萄糖或其它普通微生物代谢物的存在下，培养改变的宿主细胞，在细菌宿主细胞中积累2-KDG的方法。更具体地，通过失活编码膜结合2-酮基-D-葡萄糖酸脱氢酶(2-keto-D-gluconate dehydrogenase(2-KDGDH))的内源性基因，2-KDG不转变为中间产物2，5-DKG，2-KDG在改变的宿主细胞中累积。随后，可以从改变的宿主细胞分离出2-KDG，并将其用于各种商业用途或将其进一步用于产生其它所需化合物如异抗坏血酸。