[发明专利]含多角体基因的重组载体及其表达与纯化蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种含多角体蛋白基因的重组质 粒及其制备方法与蛋白质表达、纯化的方法。

背景技术

昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受 到人们的重视。杆状病毒的基因在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达 的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包涵体的主要成 分，感染后期在细胞中的积累可高达30％～50％，形成结晶体，是病毒复制非 必需成分；P10蛋白也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物 质。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆，这两个基因的启动子具 有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体理想的外源 基因插入位点。

由于杆状病毒基因组很大，不适合使用常规的质粒克隆技术，而是将目 的基因克隆到转移载体中，再通过同源重组，使目的基因转移到杆状病毒中。 线性化病毒比环状DNA分子更利于重组，因此，人们构建了BacPAK6病毒， 它具有三个Bsu36I酶切位点，病毒经过酶切后，产生两个小片段和一个病毒 DNA大片段，这不仅使病毒线性化，也使位于多角体蛋白启动子下游的多角 体蛋白基因片段被切除，同时使病毒复制的必需基因ORF1629失活。所以只 有当重组成功后，必需基因被修复，线性化病毒才被救活。BmBacPAK6病毒 与BacPAK6病毒类似，具有杆状病毒多角体强启动子和三个Bsu36I酶切位点， 但它能专一的感染家蚕细胞。它是通过BacPAK6 DNA与野生型家蚕杆状病毒 BmNPV DNA在BmN家蚕细胞中重组而实现的。BmBacPAK6经Bsu36I酶切 后，形成线性化病毒，缺失多角体蛋白基因。

利用传统重组昆虫病毒筛选带有外源基因重组病毒时，需用显微镜按病 毒感染细胞成空斑的形态来筛选，除需要熟练的技术外，还费时，周期长， 获得的重组目的蛋白较少，不利于保藏，且目的蛋白的纯化也比较困难。另 外，膜蛋白因其自身疏水特性，不易纯化，且在大肠杆菌、酵母细胞等表达 系统中表达时，膜蛋白一般都会整合到细胞膜中，大大增加了纯化的难度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种含多角体蛋白基因的重组质粒 pBacPAKph及其制备方法。

本发明所要解决的技术问题还在于提供一种含多角体蛋白基因和目的蛋 白融合基因的重组质粒pBacPAKph-M。

本发明所要解决的技术问题还在于提供一种保藏号为CGMCC No.2768 的线性化病毒重组子及其制备方法、筛选方法和质表达与纯化蛋白的方法。

本发明的技术方案如下：

本发明所要解决的技术问题是这样实现的：

本发明首先提供一种重组质粒pBacPAKph，为pBacPAK8质粒的EcoR V 和BamH I双酶切小片段被一段核酸序列所替代的重组质粒，所述核酸序列由 多角体启动子核酸序列、终止子被突变删除的多角体蛋白编码框序列和编码 TEV蛋白酶酶切位点的核酸序列依次连接而成。由包括以下步骤的制备方法 制得：

(1)以家蚕杆状病毒DNA为模板，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序 列为引物，通过PCR扩增反应，制得扩增产物；

(2)将步骤(1)制得的扩增产物EcoR V和BamH I双酶切克隆至 pBacPAK8质粒，制得重组质粒pBacPAKph。

本领域技术人员依据常识可知，此处所述TEV蛋白酶也可以用其他能实 现本发明的蛋白酶替代。

本发明还提供了一种重组质粒pBacPAKph-M，为重组质粒pBacPAKph 的多克隆位点插入有目的蛋白基因M的重组质粒；

本发明进一步提供了一种保藏号为CGMCC No.2768的线性化病毒重组 子(该线性化病毒重组子BmBacPAKph-M由中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心保藏，地址在北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所， 保藏日期为2008年11月28日，保藏编号为CGMCC No.2768，生物材料的 分类命名：家蚕核型多角体病毒Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)。

上述保藏号为CGMCC No.2768的线性化病毒重组子的制备方法为：由 重组质粒pBacPAKph-M与线性化BmBacPAK6病毒DNA同源重组制得。