[发明专利]人凝血因子VII变体

说明书

本申请是中国申请01815604.5的分案申请，该母案于2001年9月13 日以国际申请号PCT/DK01/00596提交，于2003年03月13日进入中国国 家阶段，本分案采用了与该母案一致的发明名称。

发明领域

本发明涉及具有凝血活性的新的人凝血因子VIIa变体及编码这类变 体的核酸构建物、包含并表达该核酸的载体和宿主细胞，药物组合物、用 途以及治疗方法。

发明背景

血液凝固是由一系列不同血液成分(或因子)的复杂相互作用组成、并最 终产生纤凝块的过程。通常，血液中参与所谓凝血“级联”反应的成分，是 在激活剂(它本身是活化的凝血因子)的作用下转变为蛋白水解酶的酶学无 活性蛋白质(酶原(proenzymes或者zymogens))。已经历这种转变的凝血因子 一般被称为“活性凝血因子”，并在凝血因子名称后添加字母“a”表示(例如 凝血因子VIIa)。

止血过程的引发是由缘于血管壁损伤而暴露的组织凝血因子和凝血因 子VIIa之间复合物形成而介导的。然后，复合物将凝血因子IX和X转化 为其活性形式。在产生组织凝血因子的细胞上，凝血因子Xa把有限量的凝 血酶原转化为凝血酶。凝血酶激活血小板和凝血因子V和VIII使之成为Va 和VIIIa，后两种是进一步的过程中导致全部凝血酶爆发的辅凝血因子。此 过程包括通过凝血因子IXa(与凝血因子VIIIa构成复合物形式)产生凝血因 子Xa，并发生在活化的血小板表面。最终凝血酶将纤维蛋白原转化为导致 纤维蛋白凝块形成的纤维蛋白。近年来，凝血因子VII和组织凝血因子已被 认为是血液凝固的主要引发剂。

凝血因子VII是以单链酶原形式在血液中循环的痕量血浆糖蛋白。此 酶原无催化活性。单链凝血因子VII可以在体外被凝血因子Xa、凝血因子 XIIa、凝血因子IXa、凝血因子VIIa或凝血酶转变为双链凝血因子VIIa。认 为凝血因子Xa是凝血因子VII的主要生理性激活剂。象其它几种参与止血 过程的血浆蛋白一样，凝血因子VII的活性依赖于维生素K，这是簇集在蛋 白质氨基末端附近的多谷氨酸残基的γ-羧化作用所需要的。这些γ-羧化的 谷氨酸是金属离子-诱导的凝血因子VII与磷脂相互作用所需要的。酶原凝 血因子VII向激活的双链分子的转化，通过裂解内部的Arg₁₅₂-IIe₁₅₃肽键而 完成。在组织凝血因子、磷脂和钙离子的存在下，双链凝血因子VIIa通过 有限量的蛋白酶解迅速地激活凝血因子X或凝血因子IX。

经常期望刺激或改善个体的凝血级联反应。凝血因子VIIa已被用于控 制具有数种原因的出血病症，所述原因如凝血因子缺乏(例如例如血友病A 和B或者凝血因子XI或VII缺乏)或凝血因子抑制剂。凝血因子VIIa也已 被用于控制具有正常机能血液凝固级联反应(没有凝血因子缺乏或者针对任 一凝血因子的抑制剂)的主体的大量出血。出血可以例如由血小板功能缺陷、 血小板减少症或者冯维勒布兰德氏病(von Willebrand′s disease)引起。出血也 是与手术及其它形式组织损伤有关的主要问题。

欧洲专利200,421(ZymoGenetics)涉及编码人凝血因子VII的核苷酸序 列以及凝血因子VII在哺乳动物细胞中的重组表达。

Dickinson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，14379-14384)涉及凝 血因子VII变体，其中Lys 157、Val 158、Glu 296、Met 298、Asp 334、Ser 336或者Lys 337已经分别被Ala替代。

Iwanaga等(Thromb.Haemost.(supplement August 1999)，466，abstract 1474)涉及FVIIa变体，其中残基316-320被删除或者残基311-322被来自胰 蛋白酶的相应残基取代。

然而，仍需要具有凝血活性的凝血因子VIIa变体、具有高活性的可以 以相对低剂量施用的变体，和不产生与传统治疗有关的不希望的副作用(如 分别出现凝血系统的全身性激活和出血)的变体。

发明描述

本发明提供具有凝血活性的凝血因子VIIa多肽。