[发明专利]一种使孢子快速萌发的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使孢子快速萌发的方法，具体的说是采用改进后的培养皿法进行的孢子培养方法。

背景技术

孢子萌发是植物病理学真菌病害试验研究中经常用到的手段，比如可以作为鉴定某些真菌性状的方法，孢子的萌发实验又是杀菌剂药效测定的主要方法。同时对于某些病害的接种，也需要大量的孢子。另外在研究病原真菌的生活史，病害的侵染循环及病害的发生和流行条件等，都涉及孢子的萌发问题。因此，如何快速高效的得到高萌发率的孢子，并用这些萌发的孢子来做进一步研究，也是植病研究中重要的手段和方法。本方法是发明人本人在实验过程中总结出来的一种高通量的高效快速得到病菌萌发孢子的方法。

传统的孢子萌发方法主要有悬滴法、载玻片上萌发法、培养皿中萌发法、琼脂平板表面萌发法及其它特殊方法。发明人在实验中主要采用悬滴法和载玻片萌发法作为比较方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种使孢子快速萌发的方法，是一种改进的培养皿法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种使孢子快速萌发的方法，包括以下步骤：

A、取孢子菌株在PDA培养基上置于28±0.5℃培养箱内进行单孢培养，待菌丝长满皿后，置于光照下28±0.5℃连续照射至少4天，诱导孢子的产生。

B、用适当量的无菌水冲洗菌落表面，得到孢子液。再用4层纱布过滤得到孢子悬浮液，用无菌水稀释，使孢子浓度达到10⁵个/ml。

C、参照方中达《植病研究方法》，取配置好的孢子悬浮液进行悬滴法和载玻片萌发法操作实验。

D、把从步骤B得到的部分孢子悬浮液离心，保留部分上清约100ul，其余上清丢弃，保留孢子备用。

E、无菌条件下，把灭过菌的孔径为0.45um的透明微孔滤膜平铺在事先准备好的PDA平板上，使膜与培养基表面紧密接触，不留空隙。膜大小以刚能全部遮住培养基为准。

F、取离心得到的100ul孢子悬浮液平铺到滤膜上，用三角玻棒摊匀，用封口膜封口后置于28±0.5℃培养箱培养。

G、培养一定时间后即可在显微镜下直接观察孢子的萌发率，或者用无菌水冲洗萌发的孢子，得到萌发的孢子悬浮液(此过程禁用三角玻棒刮)。经预试验两种观察方法得到的结果一样，采用观察孢子悬浮液的方法。

H、所有三种处理都是在培养5h和8h后在显微镜下观察孢子萌发率。每个处理观察10个视野。其中孢子萌发标准为：以芽管长度超过孢子直径长度(指直径最小的一边)的一半，视为已经萌发的孢子。

本发明的有益效果为：与常用的孢子萌发方法相比，在相同的时间条件下，可以大幅度提高孢子萌发率。

具体实施方式

下面以香蕉枯萎菌和西瓜枯萎菌两种菌为材料的基础上，采用载玻片发、悬滴法和本方法进行比较，数据及分析如下：

1、三种方法下，FOC-4R的孢子萌发率比较(表1)

表1，FOC-4R的孢子萌发率

由表1中可以看到，使用三种方法得到的孢子萌发率以对照1的萌发率最低，即使是在处理8h后，也仅能达到6.5％，虽然对照2的萌发率在处理相同时间后达到了39.2％，但与改良的培养皿法高达77.3％的萌发率相比，还是相差甚远。FOC-4R菌株在使用改良的培养皿发后，无论在处理5h或8h后，孢子的萌发率都显著高于其它两种方法。

2、三种方法下，FW的孢子萌发率比较(表2)

表2，FW的孢子萌发率

由表2可知，无论在处理时间和处理方法下，使用对照1的孢子萌发率最低，特别是在处理5h的情况下，仅能达到1.8％，而在同样条件下，使用了改良方法的孢子其萌发率都是最高的，特别是在处理了8h后，萌发率可以高达92.7％，几乎全部萌发。FW菌株其孢子萌发率在使用改良的培养皿发后，无论是在处理5h或是8h，其萌发率都显著高于其它两种对照方法。

改良的培养皿法是在原有的培养皿方法基础上改进而来的。发明人在实验过程中，因为需要萌发率相当高的孢子来做研究，而由于这两种孢子需要高湿度环境才能萌发。在实验了现有的几种孢子萌发方法后，都达不到理想的要求。因此才设计和试验了这种方法。结果发现，用改良的培养皿法进行孢子萌发实验，其萌发率可以很容易控制并能达到实验要求。如果需要全部萌发，对于香蕉枯萎菌4号小种来说，萌发时间控制在10个小时即可。而对于西瓜枯萎菌来说，只要8小时即可。