[发明专利]牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法

权利要求书

1.牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法，其特征在于操作步骤为：

(1)用5mL一次性无菌注射器分别从4条体长20cm左右的实验牙鲆的尾静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血1:1～1.5混合，收集抗凝血冰盒中暂存；

(2)将抗凝血用0.1M PBS缓冲液1:1稀释，与比重为1.08～1.09的淋巴细胞分离液按1：2比例混合，于4℃条件下3000rpm水平离心15min；离心后外周血细胞分为4层，小心吸走上层的分离液、白细胞和血浆，将底层的红细胞沉淀用0.1M PBS缓冲液4℃离心洗涤3次，去除上清液；

(3)向红细胞沉淀中加入20倍体积的低渗缓冲液，置于4℃条件下30min，使红细胞充分溶胀破膜，4℃条件下，12000rpm离心15min收集牙鲆红细胞膜沉淀；

(4)向红细胞膜沉淀中加入10～15mL低渗缓冲液，用漩涡混合器将红细胞膜沉淀打散，4℃条件下12000rpm，15min离心，得到经洗涤的红细胞膜沉淀，重复上述洗涤步骤2～4次；

(5)向牙鲆红细胞膜沉淀中加入2～3倍体积的膜蛋白裂解液，磁力搅拌过夜，以充分裂解牙鲆红细胞膜，裂解过程于冰浴中进行；

(6)裂解后所得溶液于4℃下，12000rpm离心30min，上清即为牙鲆红细胞膜蛋白提取液，分装后于-80℃冰箱中保存，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测牙鲆细胞膜蛋白提取液的蛋白浓度。

2.根据权利要求1所述牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法，其特征在于使用的专用液配方为：

(1)低渗缓冲液：

5mM pH7.8的PBS缓冲液，0.5mM EDTA，1μg/mL抑肽酶；

(2)膜蛋白裂解液：

50mM pH7.8的Tris-HCl，150mM NaCl，1％ Triton X-100，0.1％ SDS，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/mL Aprotinin，1％ NP 40，0.5％去氧胆酸钠，5mMPBS，0.5mM EDTA，0.85％生理盐水；

(3)阿氏抗凝剂液：

葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，加热溶解后将pH值调到6.1，经8磅(115℃)，15分钟的高压灭菌后分装。

3.根据权利要求1所述牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法，其特征在于操作步骤(4)中用低渗缓冲液重复洗涤步骤3次。