[发明专利]牙鲆红细胞外膜蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类红细胞的采集处理和红细胞外膜蛋白制备技术领域。

背景技术

牙鲆在我国俗称牙片、偏口，品种优良，生长快速，肉质鲜美，是我国优良的海水鱼类增养殖品种之一。目前随着牙鲆养殖业的发展，养殖规模的扩大，养殖牙鲆各种病害频繁爆发，造成了巨大的经济损失。鱼类具备一个相对完善的免疫系统，可通过特异性和非特异性免疫来防御各种病原的侵袭。外周血细胞是鱼类非特异性免疫防御体系中的重要防线之一^1，2。但是有关鱼类红细胞免疫功能以及红细胞免疫分子的研究尚未见明确报道，对于牙鲆红细胞外膜蛋白的制备技术仍属空白。

目前针对鱼类红细胞免疫功能和红细胞外膜蛋白的研究，存在以下几个问题：

1.鱼类红细胞的免疫功能没有引起研究人员的重视

一般认为，红细胞的主要功能是携带O₂和CO₂，但是1981年Siegel提出了“红细胞免疫系统的新概念，促进了红细胞免疫研究发展³。这些工作在人类以及其他哺乳类和鸟类中开展最多，但在鱼类中有关红细胞免疫的报道很少，认识不够。

2.有关鱼类红细胞免疫机理的研究基础薄弱

对于鱼类红细胞免疫功能的作用机理尚不了解，参与免疫反应的重要分子和作用方式也未查明，缺乏对红细胞免疫分子的深入分析和鉴定，无从下手开展研究。

3.有关鱼类红细胞外膜蛋白的制备未见报道

目前有关细胞膜蛋白的研究多集中于高等脊椎动物，而有关低等的鱼类细胞膜的研究还未见报道⁴。

参考文献

1.周永灿，邢玉娜，冯全英.鱼类血细胞研究进展.海南大学学报(自然科学版)，2003，21(2)：171-176。

2.邢婧，战文斌，曾晓华等.牙鲆(Paralichthys olivaceus)红细胞单克隆抗体与五种养殖鱼类血细胞的交叉反应.海洋与湖沼，200536(2)：123-129。

3.Siegel I，LiuT L，Gleicher N.The red-cell immune system.Lancet.198112；2(8246)：556-9。

4.张领兵，伦艳妮，于乐洋等SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳与液质联用技术分离和鉴定小鼠巨噬细胞膜蛋白.中国生物工程杂志，2007，27(4)：77-82。

发明内容

本方法的主要原理：根据外周血不同类型细胞的密度不同，选用合适比重的分离液将红细胞从外周血细胞中分离出来获得单一组分，从而排除其他细胞的影响。利用添加了蛋白酶抑制剂的低渗溶液溶胀红细胞获得细胞膜组分，再通过温和的膜蛋白裂解液以及冰浴涡旋搅拌的方式，将膜蛋白成分提取出来。

本发明是在经过实验摸索优化实验条件和流程，建立了牙鲆红细胞外膜蛋白的制备技术，技术方案如下：

(1)用5mL一次性无菌注射器分别从4条体长20cm左右的实验牙鲆的尾静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血1:1～1.5混合。收集抗凝血冰盒中暂存。

(2)利用比重为1.08～1.09的淋巴细胞分离液分离牙鲆外周血中的红细胞。将抗凝血用0.1M PBS缓冲液1:1稀释，与淋巴细胞分离液按1：2比例混合，于4℃条件下3000rpm水平离心15min。离心后外周血细胞分为4层，小心吸走上层的分离液、白细胞和血浆，将底层的红细胞沉淀用0.1M PBS缓冲液4℃离心洗涤3次，去除上清液。

(3)向红细胞沉淀中加入20倍体积的低渗缓冲液，置于4℃条件下30min，使红细胞充分溶胀破膜。4℃条件下，12000rpm离心15min收集牙鲆红细胞膜沉淀。

(4)向红细胞膜沉淀中加入10～15mL低渗缓冲液，用漩涡混合器将红细胞膜沉淀打散，4℃条件下12000rpm，15min离心，得到经洗涤的红细胞膜沉淀。重复上述洗涤步骤2～4次。

(5)向牙鲆红细胞膜沉淀中加入2～3倍体积的膜蛋白裂解液，磁力搅拌过夜，以充分裂解牙鲆红细胞膜。裂解过程于冰浴中进行。

(6)裂解后所得溶液于4℃下，12000rpm离心30min，上清液即为牙鲆红细胞膜蛋白提取液。分装后于-80℃冰箱中保存。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测牙鲆细胞膜蛋白提取液的蛋白浓度。

本制备方法相比与现有文献中描述的方法程序更为简单，效率更好，既保证了膜蛋白制备的高效性，又保持了膜蛋白的生物活性。

附图说明