[发明专利]一种新疆雪莲组织培养丛生苗及其大规模继代培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及可迅速分化丛生苗、稳定、高产，可继代的新疆雪 莲愈伤组织XCSY-1及其选择方法，本发明还涉及一种新疆雪莲组 织培养丛生苗及其大规模继代培养的方法。

背景技术

雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.et Maxim.)菊科凤毛菊 属雪莲亚属的草本植物。雪莲是高山地区的民间药用植物，用于散 寒除湿、活血通经、抗炎镇痛等，民间多用于风湿性关节炎、妇女 小腹冷痛、闭经，胎衣不下、麻痹不透、肺寒咳嗽、阳痿、高山不 适应症等症的治疗。近年来，雪莲作为民族药在抗炎镇痛、抗早孕、 抗衰老及抑制癌细胞增生方面的作用倍受关注。但我国雪莲主要分 布在4000m以上的高原寒带地区，如新疆、甘肃、四川、云南和西 藏。这些地区气候多变，冷热无常，最高月平均气温3-10℃，最低 月平均气温则在零下十几度到几十度，生长环境十分恶劣，只有耐 寒的苔草属、蒿草属以及少数高山多年生草本植物与之伴生，一般 在此环境下的雪莲植物大多为多年生，生长缓慢，人工栽培困难， 长期以来掠夺性采挖已使雪莲资源严重匮乏，已使得雪莲成为濒危 物种，自然资源难以满足临床日益增长的需要。因此应用组织培养 的方法进行雪莲的开发即可以满足临床对雪莲药物的需求，也可以 保护自然资源，维护生态环境。

现有技术表明，对雪莲丛生苗的诱导与培养多为器官发生，采 用这方方法的问题是，生产雪莲丛生苗的过程中会耗费很多人力、 物力，并且，由芽生长的雪莲丛生苗，生长状态不均一，不便于后 期的利用与开发。国内有文献报多多是对雪莲愈伤组织进行继代规 模培养的报道，鲜有直接利用继承代方式直接培养雪莲丛生苗的报 道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提提供了一种新疆雪莲组织培养丛生 苗及其大规模继代培养的方法，该方法包括在MS改良培养基①上 诱导形成愈伤组织；在MS改良培养基②上通过愈伤组织筛选和继 代诱导出一种可稳定继代、芽点突出的愈伤组织XCSY-1，该组织在 壮苗培养基上可迅速分化成状态均一的丛生苗。通过对愈伤组织 XCSY-1进行继代增殖，可大量培养出生长状态均匀的新疆雪莲丛生 苗。该雪莲丛生苗可直接作为产品或原料，又可培育生根试管苗进 行人工种植。

本发明第二个目的在于提供一种可迅速分化雪莲丛生苗、高产、 稳定可继代的新疆雪莲愈伤组织XCSY-1，用于雪莲丛生苗的生产。

本发明以新疆雪莲(其种胚、根、茎、叶)作为外植体，诱导愈 伤组织，通过与上组织诱导丛生芽，通过反复继代培养和筛选得到 高产、稳定可继代的的新疆雪莲愈伤组织XCSY-1。该新疆雪莲愈伤 组织XCSY-1具有以下特征：生长旺盛、颜色呈嫩绿色或黄绿色， 结构紧凑、带有明显尖状突起组织，培养周期15-20天。

具体地说，本发明通过如下方法制备得到上述雪莲愈伤组织 XCSY-1：

(1)新疆雪莲无菌苗的培育

取天然新疆雪莲的种子，已通过中国科学院研究所标本馆(国 家植物标本馆)鉴定，用75％的酒精溶液浸泡30秒，用0.1％升汞 溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4-5次；用含有赤霉素 1.0mg/L—0.2mg/L的溶液中浸泡24小时；浸泡24小时后，将种子 再次使用0.1％升汞溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4-5 次；在无菌条件下剥去种子外壳，撕去种子内膜，将去皮种子接种 在配好的植株诱导MS培养基(赤霉素1.0mg/L—0.2mg/L)上，每 40毫升培养基播种10粒种子；在25℃下，避光培养4-6天，待种 子发芽后，将培养物转移至光照条件下培养3-5天，培养成雪莲植 株。

(2)愈伤组织的诱导和培养

取无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽做外植体，在无菌条件下，用 无菌手术剪刀和无菌镊子将无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽切成 2-5mm长的小段，接种在MS改良培养基①(MS基本培养基+6-BA 0.1-0.5mg/L+NAA1-3mg/L+蔗糖3％+琼脂0.6％)上，22-27℃暗培 养，7-10天诱导出愈伤组织。

(3)诱导愈伤组织XCSY-1