[发明专利]铁皮石斛原球茎培养物及其大规模继代培养的方法

权利要求书

1、一种铁皮石斛原球茎，其特征在于该培养物是经如下步骤得到的：

I、植株诱导：

A、选取健壮铁皮石斛野生苗，选取其茎端为外植体，先用流水冲洗干净， 放入灭菌的广口瓶内再用75％酒精消毒20-30秒，用无菌水冲洗2次，将冲洗 后的茎尖用0.1％的升汞浸泡8-11分钟，然后用无菌水冲洗4-5次，接种于下 列无菌培养及内，诱导无菌侧芽，在温度25±2度，光照强度1600-2000LUX、 光照时间10小时培养30天；

B、选择生长良好，色泽深绿、大小适中的的侧芽茎段为材料，在超净工 作台上接种于原球茎诱导培养基内，在温度25±2度，暗培养14天转光照强 度1600-2000LUX、光照时间10小时培养40天，即可得原球茎。

C、原球茎增殖筛选驯化：将诱导的原球茎，在25±2度，光照强度 1600-2000LUX、光照时间10小时，继代培养，45天/代，经过10代继代筛选， 获得可用于无激素培养的铁皮石斛原球茎；

D、原球茎继代

将筛选的原球茎在间歇式液态培养基上，接种浓度8-10％，25±2度，光 照强度1600-2000LUX、光照时间10小时间歇式培养18-22天，转移到固态培 养基1-1.5g/瓶，25±2度，光照强度1600-2000LUX、光照时间10小时培养 45天

2、根据权利要求1所述的铁皮石斛无激素培养方法，所述培养基：

分别称取硝酸钾190重量份、硝酸铵165重量份、硫酸镁37重量份、磷 酸二氢钾17重量份、氯化钙44重量份，分别加水1000体积份，并加热至完 全溶解；将5种溶液混合，加水至5000体积份，混合均匀，得MS培养基母液 A，4℃保存备用；

分别称取硫酸锰6.76重量份、硫酸锌3.44重量份、硼酸2.48重量份、 碘化钾0.332重量份、钼酸钠0.1重量份、硫酸铜0.00005重量份、氯化钴 0.00005重量份，分别加水200体积份，并加热到完全溶解；将7种溶液混合， 加水至2000体积份，混合均匀，得MS培养基母液B，4℃保存备用；

分别称取EDTA-2Na7.45重量份、硫酸亚铁5.57重量份，分别加水1000 体积份，并加热至完全溶解；将2种溶液混匀，加热，加水至2000体积份， 得MS培养基母液C，4℃保存备用；

称取甘氨酸0.4重量份、盐酸硫胺素0.08重量份、盐酸吡哆素0.1重量 份、烟酸0.1重量份、肌醇20重量份，加水1000体积份，并加热至完全溶解， 加水至1000体积份，混合均匀，得MS培养基母液D，4℃保存备用；

取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾；加入MS培养基 母液A50体积份、MS培养基母液B10体积份、MS培养基母液C20体积份、MS 培养基母液D10体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体 积份搅拌后，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水 至4000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得侧芽诱导1/2MS培养基； 分装；灭菌；备用；

选取健壮铁皮石斛野生苗，选取其茎段为外植体，先用流水冲洗干净，放 入灭菌的广口瓶内再用75％酒精消毒20-30秒，用无菌水冲洗2次，将冲洗后 的茎尖用0.1％的升汞浸泡8-11分钟，然后用无菌水冲洗4-5次，接种于下列 无菌培养及内，诱导无菌侧芽，在温度25±2度，光照强度1600-2000LUX、光 照时间10小时培养30天；

II、诱导原球茎：

按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000体积份、MS培养基母液B2000 体积份、MS培养基母液C2000体积份、MS培养基母液D1000体积份，4℃保存 备用；取0.15～0.25重量份NAA，滴加4％氢氧化钠至完全溶解，加水至1000 体积份，摇匀，得NAA母液，4℃保存备用；取0.05～0.15重量份6-BA，滴加 4％氢氧化钠至完全溶解，加水至500体积份，摇匀，得6-BA母液，4℃保存备 用；取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾；加入上述MS培 养基母液A200体积份、MS培养基母液B20体积份、MS培养基母液C40体积份、 MS培养基母液D20体积份、NAA母液20体积份、6-BA母液40体积份，得混合 培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体积份，搅拌，加入上述混合培养 基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至4000体积份；滴加4％氢氧化 钠，调pH至5.8，得诱导原球茎MS培养基；分装；灭菌；备用；

III、铁皮石斛原球茎筛选

按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS 母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4℃保存备用；称取蔗糖1200重量 份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A1000体积份、培 养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积份、 香蕉泥400重量份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000体积 份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至40000 体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得继代培养MS培养基；分装；灭菌； 备用；

IV、石斛间歇式液态培养基

按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS 母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4℃保存备用；称取蔗糖1200重量 份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A1000体积份、培 养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积份、 香蕉提取液400重量份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000 体积份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水 至40000体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得液态1/2MS培养基；分 装；灭菌；备用；

V、石斛原球茎继代

按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS 母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4℃保存备用；称取蔗糖1200重量 份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A1000体积份、培 养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积份、 香蕉泥400重量份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000体积 份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至40000 体积份；滴加4％氢氧化钠，调pH至5.8，得继代培养MS培养基；分装；灭菌； 备用；

VI、如权利要求1所述的铁皮石斛原球茎，其特征在于所收集的铁皮石斛 原球茎应符合如下质量标准：水分不得过12.0％，总灰分不得过12.0％，酸 不溶性灰分不得过3.0％，浸出物不得少于15％；多糖含量得少于10％

VII、如权利要求IV或V所述的铁皮石斛原球茎的培养的方法，其特征在于 所述III步骤培养基MS培养基添加香蕉泥，原球茎的培养温度为25℃，培养周 期为45天。