[发明专利]LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药工程的药物制剂领域，涉及一种LTB(大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位)-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，该制剂用于鼻腔免疫，提高了LTB佐剂的活性，增强了流感疫苗的免疫效果。

背景技术

流感是一种常见的高发性传染病，每年都会直接或作为原发疾病引起人的死亡。目前国内外普遍使用的流感疫苗多为流感注射疫苗，但注射疫苗存在很多缺点，疫苗通过注射免疫后能够产生高水平的体液抗体，但不能有效阻止流感病毒经呼吸道粘膜侵入体内，另外注射方式存在患者顺应性差、注射器和针头导致感染、疫苗需多次接种、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点。

LTB是肠产毒性大肠杆菌分泌的一种热不稳定性肠毒素的B亚单位，它具有很强的黏膜免疫原性和黏膜佐剂活性，能有效地启动机体局部和全身的体液免疫和细胞免疫，已成为黏膜疫苗研究的重要佐剂。LTB作为疫苗佐剂，为了提高佐剂效应，与流感疫苗结合大多采用简单混合或融合蛋白的方式。LTB与流感疫苗简单混合免疫的方法比较简单，使用比较方便，但LTB作为佐剂抗原提呈性低，提高小鼠血清及黏膜的抗体水平有限，体液免疫和细胞免疫水平相对较低。采用蛋白融合的技术将LTB和流感疫苗形成融合蛋白来实现，但此方法专属性较强，操作复杂，纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，整个后处理过程工艺复杂，工艺量大；流感疫苗易受到酶的破坏而降解，制备工艺复杂且不具有普遍性，融合蛋白可能引入无关抗原，有免疫原性，不能多次给药。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术存在的上述问题，提供一种LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗鼻腔免疫微球的制备方法，使LTB佐剂活性得到进一步增强，提高流感疫苗的免疫水平，既能产生较强的体液免疫抗体又能产生高效的局部粘膜免疫，且可简化生产工艺，降低成本。

本发明使用一种化学性质非常活跃的双功能试剂碳化二亚胺类化合物，利用它既可与羧甲基壳聚糖的羧基又可与LTB的氨基缩合的性质，合成LTB-羧甲基壳聚糖交联物，以交联物和流感裂解疫苗为原料，表面活性剂为辅料，通过单乳化法制备微球，反应过程为：

为了达到本发明的目的所采取的具体技术方案是：

1、取羧甲基壳聚糖溶液和氯化钠溶液混合得混合水溶液，碳化二亚胺类化合物溶解于二甲基亚砜溶剂中，向混合水溶液中加入含有碳化二亚胺类化合物的二甲基亚砜溶液，搅拌30～60分钟，4～8℃反应1～8小时，最终得混悬液，向混悬液中加入LTB的PBS缓冲液，pH6.5～8.0，4～8℃反应1～8小时，加入甘氨酸反应1～4小时，反应液过硅胶柱，洗脱液：乙酸-水-丁醇，摩尔比为1：1～3：4～8，收集产物；用流动去离子水透析24～48小时，收集透析液的LTB-羧甲基壳聚糖交联物，LTB、甘氨酸、碳化二亚胺类化合物、氯化钠、羧甲基壳聚糖质量比为1：1～10：1～10：1～10：50～100；

2、取LTB-羧甲基壳聚糖交联物溶解于PBS缓冲液中，pH6.5～8.0，将流感裂解疫苗和表面活性剂溶解在LTB-羧甲基壳聚糖交联物PBS缓冲液中作为水相，流感裂解疫苗、表面活性剂与交联物的质量比为1：10～50：100～500；

3、将第二步的水相加入到油相中，搅拌形成稳定的乳液；其中水相与油相的体积比为1：5～20，搅拌45～90分钟，转速为500～4000转/分钟；

4、向第三步制得的乳液中加入浓度为1～30％(w/v)的固化剂，乳液与固化剂溶液的体积比1：1～2，继续搅拌1～3小时后停止；

5、离心分离第四步制得的分散体系，分出下层的微球，洗涤，真空干燥得到LTB-羧甲基壳聚糖流感疫苗微球。

上述的碳化二亚胺类化合物是二乙基碳化二亚胺、二苯基碳化二亚胺、乙丙基碳化二亚胺或1-乙基-3(3，-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。

上述的表面活性剂是Span 20、Span 40、Span 60、Span 80、吐温20、吐温40、吐温60或吐温80。

上述的油相是液体石蜡、花生油、玉米油、大豆油或橄榄油。

上述的固化剂是甲醛、戊二醛、香草醛、三聚磷酸钠、硫酸钠或柠檬酸钠。

上述的离心分离时分别用石油醚和蒸馏水依次充分洗涤，并在室温下真空干燥。