[发明专利]一种组织工程用海藻酸钠的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程用天然多糖，具体地说是一种组织工程用海藻酸钠的制备方法。

背景技术

海藻酸钠(简写NaAlG)又名褐藻胶，由β-D甘露糖醛酸(M)和α-L古罗糖醛酸(G)通过(1-4)糖苷键聚合而成的线性阴离子天然多糖，生物相容性良好，是组织工程热点材料之一[Wang W，Liu XD，Ma XJ，et al.J.Mater.Chem.，2006，16：3252-3267]。现有海藻酸钠制备方法包括酸凝酸化法、钙凝酸化法、钙凝离子交换法、酶解提取法等，但研究表明海藻酸钠中残留的杂蛋白、内毒素等杂质是影响其生物相容性的重要因素[Zimmermann U，Klock G，Federlin K，et al.Electrophoresis 1992，13(5)：269-74.]，对此，从上世纪七十年代开始，许多研究者都致力于海藻酸钠中杂蛋白、内毒素等杂质的去除研究，其中德国学者Klock等提出的Klock法与荷兰学者De Vos P提出的De Vos P法对于上述杂质的去除效果较好。Klock法可分为13个步骤[Klock G，Frank H，Houben R，et al.Appl Microbiol Biotechnol 1994Jan；40(5)：638-43]：(1)首先将海藻酸钠粉末分散在氯仿溶液中，萃取0.5小时后，分离海藻酸钠；(2)将海藻酸钠溶解在蒸馏水中(1.5％w/v)；(3)向海藻酸钠溶液中加入酸性活性炭，搅拌4小时后，溶液经膜过滤；(4)向海藻酸钠溶液中加入中性活性炭，搅拌4小时后，溶液经膜过滤，(5)将海藻酸钠溶液滴加到BaCl₂溶液中形成凝胶微球；(6)将上述凝胶微球置于1M醋酸溶液中浸泡14小时(pII 2.3)，将凝胶微球用蒸馏水洗涤，此步骤重复3次；(7)再将凝胶微球置于500mM柠檬酸钠溶液中浸泡8小时(pH 8.0)将凝胶微球用蒸馏水洗涤，此步骤重复3次；(8)将凝胶微球浸泡在5L(含有5％的丙酮)50％乙醇溶液中16小时；(9)再将凝胶微球转移至5L(含有5％的丙酮)70％乙醇溶液中，浸泡16小时后，先后经BaCl₂溶液与蒸馏水充分洗涤；(10)将凝胶微球置于到1L 250mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液中过夜(pH10.0)，得到的溶液经0.2μm硝酸纤维素膜过滤；(11)将溶液置于进行透析20小时(膜截流分子量为50kDa)；(12)最后在无菌环境中，用无水乙醇将海藻酸钠沉淀出来；(13)将上述海藻酸钠沉淀经12小时干燥，得到纯化海藻酸钠。该方法与本发明相比较：Klock法使用了氯仿毒性较大的有试剂；处理过程冗长；产率低。De Vos P法可分为9个步骤[De Vos P，De Haan BJ，Wolters GH，Strubbe  JH，Van Schilfgaarde  R.Diabetologia 1997；40(3)：262-270][KR20020039473 20020708]：(1)将海藻酸钠粗品溶解在1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸钠(EGTA)溶液中(1.0％w/v)，经膜过滤；(2)将溶液用2N HCl与20mM NaCl混合溶液调节pH 2.0，形成凝胶沉淀，用布氏漏斗过滤后(1.5mm)，再用0.01N HCl与20mM NaCl混合溶液洗涤凝胶沉淀3次；(3)将凝胶沉淀分散到100mL 0.01N HCl与20mM NaCl混合溶液中，再加入20mL氯仿和5mL正丁醇，剧烈震荡0.5小时后用布氏漏斗过滤，此步骤重复3次；(4)将凝胶沉淀用0.5N NaOH与20mM NaCl混合溶液(pH＝7.0)溶解；(5)将溶液用氯仿/正丁醇混合液萃取0.5小时(每100mL海藻酸钠溶液加入20mL氯仿和5mL正丁醇)，离心相分离，得到海藻酸钠溶液；(6)向海藻酸钠溶液中加入无水乙醇形成海藻酸钠沉淀(v海藻酸钠溶液∶v乙醇＝1∶2)，经布氏漏斗过滤；(7)将海藻酸钠沉淀先后经无水乙醇和乙醚洗涤；(8)最后在无菌环境中，将上述海藻酸钠沉淀经12小时干燥，得到纯化海藻酸钠。该方法与本发明相比较：De Vos P法原理为形成海藻酸凝胶，这使得高分子多糖易降解，产率低。方法中使用了氯仿毒性较大的有试剂，操作安全性差。