[发明专利]食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒，其特征在于包括浓度为5U/μL的 Taq DNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM及3种产芽孢菌的引物对各10μM，所述 的引物对序列如下：

其中，N₁是A、T或C；N₂是A或G；N₃是C或T；N₄是A或T；N₅是 A或T；N₆是G或A；N₇是C或T；N₈是C或T；N₉是C或T；

试剂盒保存条件：-20℃保存。

2.食品中三种产芽孢菌的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试 剂盒，包括如下步骤：

①取2ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的PCR反应液、0.2μL Taq DNA聚合酶及灭菌超纯水12.8μL，总体积25μL；5000r/min离心10s，然 后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环；

终止延伸：72℃，7min；

PCR产物4℃保存；

②将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射 谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

色谱柱：PS-DVB&C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B，

3.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B，

6.2min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B，

8.4min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B，

10.4min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B，

12.4min，35.0％缓冲溶液A，65.0％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至 1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水 定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

上样量：PCR产物5μL。