[发明专利]食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品中三种产芽孢菌的检测试剂盒及其检测方法。尤其涉及用于PCR-DHPLC快速高通量检测的试剂盒及其相应的检测方法。 

背景技术

一直认为食品加工过程中热处理会破坏所有微生物群落，但实际研究发现，超高温处理食品中仍会有耐热性菌以及芽胞残留；尤其巴氏加热法处理的食品，只能杀死其中大部分细菌，仍存在大部分嗜热菌及耐热性菌以及芽胞等。同时，即使超高温处理，芽胞菌产生的毒素也不会被灭活，残存的芽胞菌及毒素是热加工食品中潜在的生物危险因子。适宜条件下，残存细菌重新繁殖并产生毒素。热加工处理食品中残存的未知芽胞杆菌污染及其产生毒素导致的食源性疾病经常发生，是潜在食品卫生和安全隐患。至少包括蜡样芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌等多种芽胞杆菌可能在热加工处理食品中存在。产毒素芽胞菌如蜡样芽胞杆菌产生的肠毒素，肉毒梭状芽胞杆菌产生的肉毒毒素等在超高温处理过程下，仍保持活性。热加工处理食品中产孢子菌及其毒素对食品卫生和安全的影响应该引起重视。 

肉毒梭菌所致食物中毒，是肉毒梭菌在食品中于厌氧状态下繁殖产生外毒素而引起的一种典型的毒素型中毒。此毒素毒性极强，人的最小致死量为0.1μg。最早报告本菌引起的食物中毒，是1895年在比利时因吃腌制火腿所引起的20多人中毒的事件，在火腿瘦肉和死者内脏中都检出肉毒梭菌。引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。在美国以家制罐头发生中毒的较多，日本以鱼制品较多。在我国主要与堆放牛羊肉和发酵食品等有关，由香肠引起的肉毒中毒事件也有报告。 

蜡样芽胞杆菌食物中毒所涉及的食品种类繁多，包括奶类食品、禽畜肉类制品、蔬菜、汤汁、豆芽和米饭等。在我国引起中毒的食品大多与米饭或淀粉类制品有关，欧美国家多由甜点心、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起。蜡样芽胞杆菌食物中毒是由于该菌产生肠毒素所致。大量活菌的存在，不仅可使肠毒 素量增高，且可促进中毒发生。近年来，英国发生5起蜡样芽胞杆菌严重食物中毒事件。在我国部分地区，蜡样芽胞杆菌食物中毒占细菌性食物中毒的首位。 

由于产芽孢杆菌类培养条件较为特殊，国内外缺少检测、鉴定和定量产孢子菌类的快速和易用的检测技术和检测试剂盒。欧盟食品安全规范中除了蜡样芽孢杆菌和亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌及嗜温芽胞杆菌外，没有产芽孢杆菌类的检测标准方法。 

在我国，对产芽孢杆菌检测还多停留在检测效率低、目标单一的水平上，还主要依靠传统的增菌、分离、生化鉴定方法，一般说来鉴定一种产芽孢细菌需要10～20天，这就影响了检测鉴定的周期，该现状显然不能满足目前食品安全迅速发展的需求。即便现在已经发展起来了PCR和实时PCR技术，但也仅可达到对已知的常规致病菌进行检测。而对于混合微生物样本、不常见的、苛刻的、发生变异的芽孢细菌则缺乏稳定而可靠的鉴定手段。因此，急需建立高效、快捷、简便的检测方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵敏快速检测食品中三种产芽孢菌，包括蜡样芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌、产气荚膜梭菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒。 

本发明所述的试剂盒包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及3种产芽孢菌的引物对各10μM，所述的引物对序列如下： 

其中，N₁是A、T或C；N₂是A或G；N₃是C或T；N₄是A或T；N₅是A或T；N₆是G或A；N₇是C或T；N₈是C或T；N₉是C或T； 

试剂盒保存条件：-20℃保存。 

本发明还提供了利用上述试剂盒检测上述这3种产芽孢菌的方法，包括如下步骤： 

①取2ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的PCR反应液、0.2μLTaq DNA聚合酶及灭菌超纯水12.8μL，总体积25μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增： 

预变性：94℃，3min； 

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环； 

终止延伸：72℃，7min； 

PCR产物4℃保存；