[发明专利]固定scFv文库的蛋白质均衡器及制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质样品的预处理，具体地说是在大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料基质上固定M13噬菌体展示scFv文库，制备一种新型的蛋白质均衡器，用其处理复杂的蛋白质样品，通过降低样品中高低丰度蛋白质的浓度差异，更好地对其进行蛋白质组学研究。

背景技术

蛋白质均衡器技术是一种有效地样品预处理手段，通过降低样品中高低丰度蛋白质浓度差异，富集低丰度蛋白质，提高蛋白质检测数目，从而在蛋白质组学研究中得到了广泛地应用。与膜去除法相比，蛋白质均衡器技术特异性更好；与染料配体去除和特异抗体去除法相比，蛋白质均衡器技术应用范围更广；与液相、等电聚焦分级预处理方法相比，蛋白质均衡器技术操作更简便、快捷。

传统的蛋白质均衡器技术是将合成的六肽库键合于硅球表面，用于处理复杂的蛋白质样品，发现未知蛋白质。由于随机合成的六肽库中含有大量不同的六肽片段，致使样品中很多蛋白质都能找到与之特异亲和的六肽配体。样品经肽库硅球均衡器处理后，很多与六肽配体特异结合的蛋白质被保留在硅球表面，通过洗脱剂将其洗脱下来用于质谱或二维电泳的分析检测。通过肽库硅球均衡器技术可以有效地减少蛋白质组动态浓度范围，富集低丰度蛋白质，使更多低丰度蛋白质得以检测。Castagna等人曾用肽库硅球均衡器技术和质谱检测对人尿蛋白质组进行了研究，处理前后的人尿样品分别检测到134和383个蛋白质，证明肽库硅球均衡器技术对提高蛋白质检出率有很大帮助(Castagna，A.；Cecconi，D.；Sennels，L.；Rappsilber，J.；Guerrier，L.；Fortis，F.；Boschetti，E.；Lomas，L.；Righetti，P.G.J.ProteomeRes.2005，4(6)，1917-1930)。最近，Sennels等人也用肽库硅球均衡器技术和LC-SELDI-TOF MS/MS检测方法对人血清蛋白质组学进行了研究，处理后的人血清样品共检测出1559个蛋白质，比之前有显著提高(Sennels，L.；Salek，M.；Lomas，L.；Boschetti，E.；Righetti，P.G.；Rappsilber，J.J.ProteomeRes.2007，6(10)，4055-4062)。此外，Carina等人也证明了肽库硅球均衡器技术可以有效地用于低丰度蛋白质的检测(Carina Sihlbom；Ida Kanmert；Helena von Bahr；Pia Davidsson.J.Proteome Res.2008，7(9)，4191-4198)。

尽管蛋白质均衡器技术已经被越来越多地用于样品蛋白质组学的研究，但是它仍然存在某些不足之处，比如非特异结合和由于缺少适当的六肽配体导致的蛋白质损失等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器及制备和应用，以减少复杂样品中高低丰度蛋白质的浓度差异，在低丰度蛋白质富集的同时实现对高丰度蛋白质的去除。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种固定scFv文库的蛋白质均衡器，于聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料表面化学键合有M13噬菌体展示scFv文库。

所述聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料为30-100μm的大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料；每mL冷凝胶整体材料表面键合1×10¹⁰-1×10¹³个M13噬菌体。

所述蛋白质均衡器的制备方法：30-100μm的大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料载体经活化后，将M13噬菌体展示scFv文库键合于其表面，每mL冷凝胶整体材料表面键合1×10¹⁰-1×10¹³个M13噬菌体，制备成固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器。

所述载体表面活化的过程为，先以过量的0.5M己二胺通入聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料、活化聚丙烯酰胺基质；再通入过量的质量分数5％的戊二醛反应，反应时间3-20小时；

所述将M13噬菌体展示scFv文库键合于载体表面的过程为，于聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料中通入含有M13噬菌体展示scFv文库的磷酸盐缓冲液，PH范围7.4～7.6，磷酸盐的盐浓度为25～30mM，键合反应温度为20-30℃，反应时间12-24小时，每mL磷酸盐缓冲液中含有1×10¹⁰-1×10¹³个M13噬菌体。

所述均衡器可用于蛋白质样品预处理，降低高丰度蛋白质的浓度并对低丰度蛋白质进行富集，降低样品复杂程度，提高蛋白质检测数目。