[发明专利]一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法

权利要求书

1.一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于：取土壤菌悬液，分别利用King’B培养基和80℃水浴10min后涂牛肉膏蛋白胨培养基的方法特异性筛选假单胞菌(Pseudomonas spp.)和芽孢杆菌(Bacillus spp.)，待用；另采集大豆根腐病病株根，利用马丁培养基分离病原真菌；采用PDA平板牛津杯对峙的方法，将上述特异性筛选的假单胞菌和芽孢杆菌中复筛出具有高效抑制所筛选的病原真菌活性的菌株，分别发酵处理后复配即可得到防治大豆根腐病的复合菌剂。

2.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于：所述King’B培养基组分为：示蛋白胨20g，磷酸二氢钾1.2g，七水硫酸镁1.5g，甘油10ml，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH＝7.4-7.6，混合后灭菌，灭菌后加入0.22um滤膜过滤除菌的氨苄青霉素，氯霉素和放线菌酮。

3.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于：所述氨苄青霉素用无菌水溶解浓度为40ug/ml；氯霉素用95％乙醇溶解浓度为13ug/ml；放线菌酮用丙酮溶解浓度为100ug/ml。

4.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨培养基组分为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH＝7.0-7.2。土壤悬液在80℃水浴锅中温浴10分钟，再稀释涂平板。

5.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于：所述的马丁培养基的配方为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，0.1％孟加拉红溶液3.3ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH自然。灭菌后加入80％的乳酸2ml。

6.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于：所述采用牛津杯平板对峙的方法中所用的固体PDA培养基配方如下：削皮土豆200g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml，pH自然。土豆切成小块儿，加入蒸馏水煮沸20min，过滤，滤液加入蔗糖，定容到1000ml，加入20g琼脂，115℃高压灭菌30min。

7.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于：PDA平板牛津杯对峙的方法，在土豆汁固体平板中央接种直径8mm的病原真菌菌丝块，在距菌丝块3cm的位置放置火焰上灼烧后的牛津杯，或者菌丝块培养1天后，再放置牛津杯，牛津杯中加入各待用假单胞菌或芽孢杆菌的培养产物，培养2-3天后，检测各菌的抑菌率。

8.按权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于：将经复筛出的假单胞菌和芽孢杆菌分别混合发酵，假单胞菌属的混合菌株在未加抗生素的上述King’B培养基中发酵培养；芽孢杆菌属的混合菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中进行发酵培养基；待两个属的菌体数量都达到10亿个/ml以上，分别用质量比2∶8-1∶9麦麸和草炭土在40-50℃下吸附风干并粉碎，然后以质量比3∶7-5∶5的比例混合，制成固体菌剂；或分别将两个属的发酵菌液都浓缩为原体积的1/2，然后按体积比3∶7-5∶5的比例混合，无菌包装制成液体菌剂。

9.根据权利要求1所述的制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法，其特征在于：假单胞菌发酵罐的条件为；无菌空气的通气量为1∶0.8-1，搅拌速度为180-200转/min，培养温度为28-30℃，培养时间为20-30h；而芽孢杆菌的发酵条件为：无菌空气的通气量为1∶0.8-1，搅拌速度为180-200转/min，培养温度为28-30℃，培养时间为40-60h，有利于形成芽孢。