[发明专利]一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生产科技领域，具体的说是一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法。

背景技术

大豆根腐病是一种分布广、危害严重、病原菌种类繁多和防治较困难的世界性病害。大豆根腐病在中国主要分布于北方春大豆和南方黄淮夏大豆生产区，其中尤其以黑龙江东北部地区发生严重。大豆根腐病主要危害大豆根系、影响作物对水分和养分的吸收。此病的发生可以使大豆植株的根重、根瘤重、固氮酶活性以及侧根数均受到不同程度的影响。据调查该病一般减产10-30％，严重时可达60％-90％，甚至绝产，而且使大豆含油量明显下降。

大豆根腐病的病原菌种类繁多，主要为：镰刀菌(Fusarium spp.)、立枯丝核菌(Rhizoctonia Solani)、腐霉菌(Pythium spp.)和疫霉菌(Phytophthora spp.)等，其中镰刀菌为优势菌，病害最为普遍，随种子发芽侵染率逐渐提高，危害大豆时，根部从根尖开始变色，呈水浸状，主根下半部显现出褐色条纹，以后逐渐扩大，表皮及皮层变黑腐烂，严重时主根下半部烂掉。叶片由下而上逐渐变黄，植株矮化，结瘤少，严重时植株死亡，危害非常严重。当地快积水时，腐霉菌和疫霉菌病害较重。

目前，对该病的防治，除了一些农耕措施(如：与禾本科作物合理轮作，适时晚播、浅播，选用和培育抗病种等)之外，主要是化学药剂的防治，如多菌灵、福美双、多克福、适时乐等，药剂拌种虽然可推迟侵染期，但是一般的大豆药剂防治根腐病时间短，药效差，因为根腐病一般会持续两个月左右，而一般的药剂有效期只有一个月左右，后期病原菌还会侵染大豆，而且长期使用化学药剂，病原菌会产生抗性变种，使防治难度加大。

利用生物制剂来防治根腐病是目前的研究热点，因为生物制剂的针对性强，无污染，有效期长。利用对病原真菌的拮抗作用筛选生防细菌，是生防菌剂的有效出路，但是生防菌剂一直存在定植难，活性低，对根部病原菌针对性不强等特点，限制了发展。目前用的比较好的大豆根腐病生防菌剂，主要是生物制剂埃坶泌(一种放线菌颗粒剂)，防治镰刀菌和紫青霉菌；还有淡紫拟青霉菌剂：其分泌物对镰刀菌有抑制作用，但有效的生防细菌菌剂还很少报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种制备防治大豆根腐病的复合菌剂的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：取土壤菌悬液，其为田间大豆根际土壤，分别利用King’B培养基和80℃水浴10min后涂牛肉膏蛋白胨培养基的方法特异性筛选假单胞菌(Pseudomonas spp.)和芽孢杆菌(Bacillus spp.)，待用；另采集大豆根腐病病株根，利用马丁培养基分离病原真菌；采用PDA平板牛津杯对峙的方法，将上述特异性筛选的假单胞菌和芽孢杆菌中复筛出具有高效抑制所筛选的病原真菌活性的菌株，分别发酵处理后复配即可得到防治大豆根腐病的复合菌剂。

所述King’B培养基组分为：示蛋白胨20g，磷酸二氢钾1.2g，七水硫酸镁1.5g，甘油10ml，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH＝7.4-7.6，混合后灭菌，灭菌后加入0.22um滤膜过滤除菌的氨苄青霉素，氯霉素和放线菌酮。所述氨苄青霉素用无菌水溶解浓度为40ug/ml；氯霉素用95％乙醇溶解浓度为13ug/ml；放线菌酮用丙酮溶解浓度为100ug/ml。

所述牛肉膏蛋白胨培养基组分为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH＝7.0-7.2。土壤悬液在80℃水浴锅中温浴10分钟，再稀释涂平板。土壤悬液在80℃水浴锅中温浴10分钟，再稀释涂平板。

所述的马丁培养基的配方为：葡萄糖10g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，0.1％孟加拉红溶液3.3ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH自然。灭菌后加入80％的乳酸2ml。

所述采用牛津杯平板对峙的方法中所用的固体PDA培养基配方如下：削皮土豆200g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml，pH自然。土豆切成小块儿，加入蒸馏水煮沸20min，过滤，滤液加入蔗糖，定容到1000ml，加入20g琼脂，115℃高压灭菌30min。

PDA平板牛津杯对峙的方法，在土豆汁固体平板中央接种直径8mm的病原真菌菌丝块，在距菌丝块3cm的位置放置火焰上灼烧后的牛津杯，或者菌丝块培养1天后，再放置牛津杯，牛津杯中加入各待用假单胞菌或芽孢杆菌的培养产物，培养2-3天后，检测各菌的抑菌率。