[发明专利]一种以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体的说是一种以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法。

技术背景

氯嘧磺隆是广谱广效的大豆田除草剂，90年代初就开始在我国使用，每公顷用有效量仅为15-22.5克，使用方便，成本低，应用面积非常广泛，我国每年大豆种植面积约900万公顷，氯嘧磺隆的使用面积就达250多万公顷，接近1/3。仅黑龙江省，每年大豆田氯嘧磺隆使用量就超过400吨，覆盖133万公顷。但是由于氯嘧磺隆不易挥发，不易光解，残留期很长，所以易对后茬敏感作物造成药害，这样就严重影响了作物的轮作，换茬及种植结构的调整，使农民只能被动的连作，造成病虫害难以控制的恶性循环。同时，氯嘧磺隆对土壤功能微生物，例如荧光假单胞菌和硝化细菌有一定的影响，也会导致土壤功能的改变甚至衰退。所以，如何消除氯嘧磺隆的残留毒害问题一直视专家们关注的热点。

目前，国内外很多专家采取了一系列措施来减少氯嘧磺隆残留所造成的危害，主要有添加复配剂降低氯嘧磺隆的用量，开发抗药性转基因作物，开发化学解毒剂等，但这些措施并不能从根本上解决农药残留问题。国内外开发微生物菌剂来消除农药残留污染的先例已经很多，而且有很多成功的案例，比如有机磷类农药，拟除虫菊酯类农药，氨基甲酸酯类农药等，但是分离出的单菌菌剂活性较低，在环境中退化和遭排斥的可能性很大，活性不稳定，限制了应用。磺酰脲类除草剂比较难降解，目前这方面的菌剂很少，但是研究发现，微生物降解也是该类农药的一个主要的降解途径，由于结构复杂，难降解，所以考虑混菌菌剂应该是生物降解农药的可行方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、高效的以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法：取土壤菌悬液，其为田间多年受氯嘧磺隆污染的土样为处理对象，制成土壤菌悬液，在1/5LB培养基中添加氯嘧磺隆浓度为100mg/L，按照体积百分比5-10％的接种量接种菌悬液，28-30℃，150-180r/min摇床培养5-7天，按体积百分比5-10％的接种量将培养液接种于新的1/5LB培养基，氯嘧磺隆的浓度按100mg/L递增，依次类推，5次转接后，培养基中氯嘧磺隆浓度为500mg/L，再按体积比5-10％的接种量转接5次，氯嘧磺隆的添加浓度始终为500mg/L，得到富集的混菌菌种，液相色谱法测得该混菌菌种对培养基中氯嘧磺隆的降解率达到70％以上，将上述菌种发酵扩大培养经处理后，即得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。

所述的1/5LB培养基的配方为：胰蛋白胨2g，酵母粉1g，氯化钠2g，蒸馏水1000ml pH＝7.0。

液相色谱法测降解率的条件为，C₁₈反相柱(4.6um×250mm)，DAD二级管阵列检测器，流动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为：70∶30∶0.1；流速为1ml/min；检测波长为254nm；柱温为28-30℃；进样量为5-10μl。

所述发酵培养为，富集得到的混菌菌种，在1/5LB培养基中，进行发酵扩大培养，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，用麦麸和泥炭在40-50℃下吸附风干粉碎，即得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。扩大培养，发酵罐的条件为：无菌空气的通气量为1∶0.8-1，搅拌速度为180-200r/min，培养温度为28-30℃，培养时间为48-60h。二级发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，用质量比2∶8-1∶9的麦麸和泥炭吸附，在40-50℃下风干粉碎。

本发明的优点在于：

1.富集得出高效混菌菌剂，降解农药残留，活性更高更稳定，成本降低。

2.取田间污染土样作为处理对象，菌种取之土，用之土，增强适应能力。

3.利用微生物降解农药残留，绿色环保，不仅保护后茬作物，更重要的是对调整种植结构，提高作物的病虫害抵抗能力。

4.本发明采用对氯嘧磺隆敏感的玉米作为指示作物，盆栽实验，能够直观地验证本发明的菌剂对土壤中氯嘧磺隆的降解效果。

具体的实施方式

实施例1