[发明专利]一种蛇毒浮肿因子抑制蛋白的制备及其应用

权利要求书

1.一种蛇毒浮肿因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：从大连蛇岛蝮 蛇血清离心，分离获得血浆和凝固成分；将粗血清进行50％的硫酸胺 沉淀，沉淀得到的蛋白质经过2次Sephadex G-200的凝胶过滤，再经 离子交换柱、亲和层析柱、反相RP-HPLC后，获得单一成分蛋白，该蛋 白分子量为25 kDa；

实验方法技术特征如下：

1）蛋白抑制蛇毒浮肿因子的活性测定法

蛇毒浮肿因子为一种磷脂酶A2，它对卵磷脂能水解而产生游离的脂肪 酸，浮肿因子抑制蛋白能中和它的作用；根据这一特性，用来测定浮 肿因子抑制蛋白的活性；以卵磷脂为反应底物，用0. 01 mol/L K OH溶液滴定由酶反应所释放出的游离脂肪酸；在酶反应初速度阶段计 算酶活力；酶比活力单位为每分钟每毫克蛇毒释放出的游离脂肪酸微 摩尔数；于上述10 mL反应混合物中加入浮肿因子抑制蛋白至浓度为 10 mg/mL，并加入待测磷脂酶A2样品200 μg，再用上述方法测定样 品的磷脂酶A2活力；

2）凝胶过滤

将大连蛇岛蝮蛇的血清离心，分离获得血浆和固定成分；将粗血清进 行50%的硫酸胺沉淀，沉淀得到的蛋白质经过2次Sephadex G-200过滤 ，采用分离柱：3×155 cm；缓冲液：0.1 M pH 7.5 Tris-HCL、 2 mM EDTA、0.05 M NaCl；流速：1.0 ml/min；每管分取：3  ml，获得对蛇毒浮肿因子具有抑制作用的蛋白；

3）离子交换

将第二次Sephadex G-200凝胶过滤分离得到的对浮肿因子具有抑制作 用的蛋白再进行阴离子交换层析DEAE-Toyopearl 650M；采用分离柱 ：1.7×15  cm；缓冲液：0.05 M pH 7.5 Tris-HCL；流速：1.0 ml/min；每 管分取：5 ml，获得对蛇毒中浮肿因子具有抑制作用的蛋白质；

4）亲和层析

将阴离子交换层析DEAE-Toyopearl 650M获得的对蛇毒中浮肿因子具 有抑制作用的蛋白，在利用浮肿因子固定化的Sepharose 4B柱子进行 亲和层系，获得能中和蛇毒浮肿因子的蛋白成分；采用分离柱：1×1 5 cm；缓冲液0.05 M pH 7.5 Tris-HCL；流速：1.0 ml/min； 每管分取：5 ml；

5）反向RP-HPLC色谱

亲和层析获得的能中和蛇毒浮肿因子的蛋白成分再经反向RP-HPLC，获 得单一层分；采用分离柱：Wakosil 5C18-200,0.46×15 cm；A缓冲 液：0.06%  TFA，B缓冲液: 80% CH₃CN和20% A；溶出梯度：在 130min内为B 0-65%；

2.权利要求1所述的制备方法制备蛋白的应用，其特征在于：利用氨基酸 测序仪测定，鉴定出该蛋白N末端70 AA和C末端20 AA；根据N末端和 C末端氨基酸序列，设计PCR引物，从大连蛇岛蝮蛇肝脏cDNA文库中， 获得该浮肿因子抑制蛋白所对应的基因序列为516bp，将获得的线性P CR产物构建到表达载体TOPO上，实现在体外表达生产对蛇毒中浮肿因 子具有抑制作用的蛋白的目的；

所述的纯化蛋白的氨基酸序列如下：

Glu Thr Cys Asn Gly Thr Met Met Thr Cys Lys Asp  Asn Glu Asp Thr 

1               5                10                15      

Cys Val Thr Phe Lys Thr Glu Leu Ile Arg Ala Pro  Leu Ser Phe Thr 

           20              25                30          

Phe Ile Ser Lys Met Cys Ser Thr Ser Asp Thr Cys  His Leu Asp Tyr 

      35               40                 45              

Val Glu Thr Asn Leu Pro His Glu Leu Ala Val Arg  Ser Lys Arg Ala 

    50               55                60                  

Cys Cys Val Gly Asp Glu Cys Lys Thr Met Pro Pro  Val Val Leu Glu 

65                70                75               80  

His His Asp Asn Arg Tyr Asn Gly Leu His Cys Pro  Gly Cys Ile Gly 

              85                90                95      

Leu Ala Ser Thr Glu Cys Asn Glu Lys Leu Val Ser  Cys Arg Asp Thr 

          100               105              110         

Glu Asn Gln Cys Leu Ser Leu Thr Gly Lys Asn Leu  Asp Phe Leu Val 

       115              120                125             

Asp Asp Ile Thr Met Lys Gly Cys Ala Thr Glu Ser  Leu Cys Thr Leu 

    130             135               140                 

Leu Gln Lys Lys Ile Phe Ser Pro Ile Ala Glu Trp  Glu Leu Asp Val 

145             150             15 5               160 

Lys Cys Thr Thr Ala Phe Pro Gln Ala Ser Gln 

             165              170