[发明专利]一种蛇毒浮肿因子抑制蛋白的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及到一种蛇毒浮肿因子抑制蛋白的制备及其应用，属于生物技术领 域。

背景技术

蛇属于低等动物，全世界大约有13科、400属、2700多种，其中四分之一 是毒蛇。我国大约有8科、53属、173种。代表了各式各样的生存环境下基因 以及功能蛋白质所对应的变化，是最直接最真实的生物进化材料。

蛇的全身都是宝，在我国有着悠久的药用历史。《本草纲目》中收载：蛇 蜕、蛇皮、蛇肉、蛇血、蛇内脏、蛇毒、蛇胆、蛇舌、蛇卵、蛇油等均可入药， 尤其是蛇毒。蛇毒是毒蛇特化的口腔腺——毒腺的分泌物，平时贮于毒腺囊中， 咬物时经颞肌收缩压挤，毒液即沿毒腺导管从毒牙排出。新鲜毒液为粘稠状的 液体，化学成分复杂，不同种类的成分也不同，除含65-82％的水分外，主要 是蛋白酶和活性多肽，能引起中毒或死亡。通常以复合毒成分的方式存在，主 要有神经毒素、肌肉坏死因子、浮肿因子、溶血因子、出血因子等。

全世界每年发生被毒蛇咬伤的事故上万人次，遭成伤残甚至死亡的人数逐 年增加，给人类的生命和财产造成巨大的损失。由于蛇毒成分复杂，其生物学、 基因组学、蛋白质组学以及蛇毒化学生物学等基础研究在国内外开展的还不深 入，找到蛇毒的有效抑制剂，用于毒蛇咬伤的治疗药物的种类和数量就非常有 限。

大连蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis)是我国特产的一种毒蛇。蝮蛇咬蝮蛇 并不致其死亡，说明蝮蛇体内存在具有中和蛇毒成分的抑制因子。对蛇毒中的 神经毒素、肌肉坏死因子、浮肿因子、溶血因子、出血因子等的分离、纯化研 究的较多，但对蛇毒抑制蛋白的开发，目前还仅仅停留在对蛇毒混合物进行中 和抑制的混合抑制蛋白资源产品的加工上，而对蛇毒成分中的单一成分进行特 异性的抑制，研究的还非常少。此外，目前的蛇毒抑制剂大多是从动物(如马) 体内获得，这就需要饲养大量的动物才能实现，而体外获得蛇毒抑制蛋白的方 法和手段还不多。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种蛇毒浮肿因子抑制蛋白的制备及制备 的蛋白的应用，采用生物技术，分离、纯化出一种对蛇毒中浮肿因子具有抑制 作用的单一成分蛋白并提供能在体外生产和获得对蛇毒浮肿因子具有抑制作用 蛋白的方法，可用于被毒蛇咬伤及其它疾病的治疗中。

本发明的技术方案：

是从大连蛇岛蝮蛇血清离心，分离获得血浆和凝固成分。将粗血清进行50 ％的硫酸胺沉淀，沉淀得到的蛋白质经过2次Sephadex G-200的凝胶过滤，获 得能抑制蛇毒中浮肿因子的蛋白成分，再经离子交换柱、亲和层析柱、反相 RP-HPLC后，获得单一成分蛋白，该蛋白分子量为25kDa，利用氨基酸测序仪 测定，鉴定出蛋白N末端70AA和C末端20AA。根据N末端和C末端氨基酸 序列，设计PCR引物；从大连蛇岛蝮蛇肝脏cDNA文库中，获得该浮肿因子抑制 蛋白所对应的基因序列为516bp，将获得的线性PCR产物构建到表达载体TOPO 上，可实现在体外表达生产对蛇毒中浮肿因子具有抑制作用的蛋白的目的，用 于临床对浮肿现象及其他疾病的治疗。

本发明的效果和益处是：大连蛇岛蝮蛇资源有限，已成为濒危物种受到国 家保护，而人工养殖因其成活率低，严重影响了蛇毒抑制蛋白的产业化发展。 目前的蛇毒抑制蛋白大多是从动物(如马等)体内获得，这就需要饲养和屠杀 大量的动物才能实现，而体外获得蛇毒抑制剂的方法可以保护野生动物免受伤 害。

本发明工艺简单、安全，蛋白易于纯化，避免了动物带给人的伤害。从表达 载体获得的对蛇毒中浮肿因子具有抑制作用的蛋白，与从动物(如马等)体内 获得的蛇毒抑制蛋白相比成本低廉。并且提供了一种针对蛇毒中浮肿因子具有 抑制作用的单一蛋白成分的生产方法，避免了以往的混合抑制蛋白对毒蛇中复 合蛇毒作用的盲目性和引起副作用的不安全性。

附图说明

图1是浮肿因子抑制蛋白的分离、纯化过程的流程图。

图2是大连蛇岛蝮蛇血清的50％硫酸胺沉淀蛋白进行二次Sephadex G-200 凝胶过滤图。

图中A是第一次凝胶过滤图，加样量500mg，获得的对浮肿因子具有抑制 作用的洗脱组份。图中B是第一次凝胶过滤获得的对浮肿因子具有抑制作用的 洗脱组份再进行第二次凝胶过滤图，加样量250mg，同样分取对浮肿因子具有 抑制作用的洗脱组份。