[发明专利]补料发酵法生产谷氨酰胺转胺酶

说明书

技术领域：

本发明是涉及补料发酵生产谷氨酰胺转胺酶的方法，更具体地说，是涉及一种吸水链霉菌的补料发酵方法生产谷氨酰胺转胺酶。

背景技术：

微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Trans-glutaminase，EC 2.3.2.13，简称MTG)是一种催化酰基转移反应的转移酶。它能催化化蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应，从而直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。近年来，商业化谷氨酰胺转胺酶主要从动物组织中提取，价格昂贵。目前，人们开始转向于研究利用微生物发酵来生产谷氨酰胺转胺酶，以满足市场对低成本高产量的谷氨酰胺转胺酶的迫切需求。

发明内容：

本发明就是针对上述问题，提供一种补料发酵生产谷氨酰胺转胺酶的方法；该生产方法通过分别在细胞生长阶段补充碳源和产酶阶段补充氮源的补料策略实现了吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的高产。

为实现本发明的上述目的，本发明如下技术方案，本发明的生产工艺是：在吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)分批发酵研究的基础上，通过在菌体生长阶段指数流加葡萄糖，进行高细胞密度培养，获得了较高的菌体量；待菌体生长进入产酶期后，通过补加氮源，为产酶提供充足的氮源，其中通过流加蛋白质氮源，可以减少蛋白酶对成熟MTG的分解，促进产酶。

本发明的有益效果：

本发明的生产工艺通过分别在细胞生长阶段补充碳源和产酶阶段补充氮源的补料策略实现了吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的高产。通过指数流加可以实现吸水链霉菌细胞的高密度生长，通过在8-16h采用较高的的比生长速率(0.15h-1)，后期降低比生长速率(0.10h-1)这种较优的葡萄糖流加速率组合，细胞干重可达到36g/L，在32h添加50g/L的豆饼粉最终酶活可达到5.79U/mL。指数流加的技术已经相对成熟，也便于实际操作，另外豆饼粉价格较低，在实际发酵过程中也易于操作，因此对吸水链霉菌进行补料发酵生产有很好的应用前景。

具体实施方式：

菌种：吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)可从市场购置。

试剂：口服葡萄糖为山东祥瑞药业有限公司产品。

α-N-Carbobenzyloxy-Glutamine-Glycine(α-N-CBZ-GLN-GLY)和L-谷氨酸-γ-单羟胺酸(HCA)由Sigma公司提供，三羟基氨基甲烷(Tris)由上海化学试剂厂提供，谷胱甘肽(还原型)由华美生物工程公司提供。其余试剂均为国产分析纯。

培养基和培养方法：发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨25，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾3.75，无水磷酸二氢钾0.25，碳酸钙5，pH 8.0。流加发酵：3L全自动发酵罐(LiFlus GM BioTRON，Korea)中装液量为1.5L，接种量6％，前期培养条件同分批发酵。待葡萄糖消耗完毕向发酵罐中按要求流加营养物，通气量1.25vvm，搅拌转速700r/min，温度控制在32℃，对发酵过程的pH不进行控制。指数流加：底物流加速率F按下式计算：

F＝{μ(VX)0/[YX/S(SF-S)]}exp(μt)，式中X，S分别为发酵罐中细胞和底物浓度(g/L)，μ为比生长速率(h-1)，V为发酵液体积(L)，SF为流加底物的浓度(g/L)，YX/S为细胞对底物的得率系数(g/g)，(VX)0为培养体系的初始细胞量(g)。