[发明专利]干海参的分子生物学鉴别方法

权利要求书

1、干海参的分子生物学鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采用高盐法提取干海参DNA；

(2)利用简并引物PCR扩增CO I基因片段；

(3)用限制性内切酶Csp6 I对PCR产物进行酶切；

(4)对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过电泳条带的数量和长度判定结果。

2、根据权利要求1所述的干海参的分子生物学鉴别方法，其特征在于：步骤(1)所述高盐法提取DNA的步骤是：

①取干海参100-200mg，在Milli-Q水中浸泡5-6小时，在液氮中研磨成粉末；

②转移至50ml离心管中，加入10ml提取缓冲液，其组成为50mM Tris，100mM NaCl，150mM EDTA，1％SDS，0.30mg/ml蛋白酶K，0.1％巯基乙醇，pH 8.0，65℃消化3h；

③缓慢加入3ml 6mol/L NaCl，盐析除去多余的蛋白及多糖，4℃ 10000rpm离心10分钟，收集上清液；

④加入等体积比例为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇，15000rpm离心10分钟，收集上清液；

⑤加入预冷的0.6倍体积的异戊醇，-20℃沉淀1-2h，室温放置15min后，15000rpm离心3分钟，去上清，收集DNA沉淀，用浓度为70％乙醇洗涤沉淀，在超净台放置5-10分钟吹晾干，溶于200ul TE缓冲液中。

3、根据权利要求1所述的干海参的分子生物学鉴别方法，其特征在于：步骤(2)所述的PCR，即聚合酶链式反应包括下列步骤：

①聚合酶链式反应的体系为25μl，各种试剂的用量分别为：

10×PCR缓冲液    2.5μl

MgCl₂ 25mM       1.6μl

dNTP  2.5mM      2.0μl

COIf  15μM      1μl

COIr  15μM      1μl

Taq酶5U/μl      0.125μl

上部提取的DNA    1μl

PCR级水          15.775μl

②聚合酶链式酶反应在PCR仪上进行，反应条件为：

94℃预变性5分钟，然后按以下条件反应35个循环反应：

94℃变性        45秒

50℃复性        45秒

72℃延伸        1分钟

循环结束后，最后72℃延伸10分钟。

4、根据权利要求1所述的干海参的分子生物学鉴别方法，其特征在于：步骤(3)所述的Csp6 I的酶切反应体系为20μl，各种试剂的用量分别为：

PCR产物                12μl

10×酶切缓冲液         2μl

Csp6 I(10U/μl)        1μl

去离子水               5μl

将以上各种试剂混匀，置0.2ml PCR管中，37℃温浴4小时，中间轻弹2-3次。

5、根据权利要求1所述的干海参的分子生物学鉴别方法，其特征在于：步骤(4)所述的琼脂糖凝胶电泳检测步骤为：取8μl酶切产物，用2.5％琼脂糖凝胶在120V下，电泳1-2小时，同时加入DNA标准，取出凝胶置紫外光下观察电泳条带，与DNA标准对比，通过电泳条带的数量和长度判定结果。

6、根据权利要求1或3所述的干海参的分子生物学鉴别方法，其特征在于：步骤(2)所述的PCR扩增所使用的引物序列分别为：

COIf：ATAATGATAGGAGG[A/G]TTTGG

COIr：GCTCGTGT[A/G]TCTAC[A/G]TCCAT。

7、根据权利要求1或5所述的干海参的分子生物学鉴别方法，其特征在于：步骤(4)所述的琼脂糖凝胶电泳检测的电泳条带酶切结果的标准带谱为：

青刺参(Apostichopusjaponicus)         386bp+306bp

红刺参(Apostichopusjaponicus)         692bp

新西兰海参(Australostichopus mollis)  539bp+153bp

黑乳海参(Holothuria nobilis)          306bp+288bp+98bp

黄乳海参(Holothuria fuscogilva)       594bp+98bp。