[发明专利]干海参的分子生物学鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种包含酶或微生物的测定或检验方法，具体涉及一种干海参的分子生物学鉴别方法。

背景技术

海参在分类学上属于棘皮动物门，海参纲，极具营养价值和经济价值，国内主要的养殖品种为仿刺参(Apostichopus japonicus)，干仿刺参是消费者购买的主要产品。随着人们生活水平的提高，海参需求量大幅上升，产品鉴定成为急需解决的关键性技术问题。目前我国从国外引进了多种海参，包括从日本引进的红刺参(Apostichopus japonicus)，新西兰海参(Australostichopus mollis)，黑乳海参(holothuria nobilis)，黄乳海参(holothuriafuscogilva)等。不同种的干海参之间价格差距比较大，但海参在经过多道工序加工成干品之后，很难从外部形态上分辨其种类。而缺乏有效的鉴别方法，导致市场流通比较混乱。

分子生物学技术给这一问题提供了很好的解决办法，CO I基因序列在生物物种中非常保守，被广泛应用于物种的分类和进化研究。利用其在不同物种之间存在的核酸序列差异，使用限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，可以产生不同长度和数量的核酸片段，通过琼脂糖凝胶电泳即可分辨出不同种类。此方法在我国干海参鉴定中还未见有公开报道，这将为干海参鉴定提供科学的方法，对规范干海参市场提供技术支持。

公告号：CN 101130815A，公告日：2008.02.27的中国专利文献公布了“华南沿海七种蛎属牡蛎的PCR-RFLP鉴别方法”介绍了一种用于鉴定牡蛎的分子生物学方法，该发明方法设计的牡蛎聚合酶链式反应的引物序列为：

CO I L1：5’-CGGTGTTTATCAAAAACAT-3’；

CO I H：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’.

利用限制性内切酶Nis I/Alu I和Nis I/Dde I对PCR产物进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，判定结果。该发明能够实现对牡蛎的快速、准确地鉴别。但是该鉴别方法却不能用于干海参的鉴别上。

发明内容

本发明的目的是针对现有干海参形态学鉴别不准确，科学鉴别技术普遍缺乏的不足，提供了一种科学有效、简便快捷、准确的干海参的分子生物学鉴别方法。

本发明的目的是通过以下技术手段实现的：干海参的分子生物学鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采用高盐法提取干海参DNA；

(2)利用简并引物PCR扩增CO I基因片段；

(3)用限制性内切酶Csp6 I对PCR产物进行酶切；

(4)对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过电泳条带的数量和长度判定结果。

步骤(1)所述高盐法提取DNA的步骤是：

①取干海参100-200mg，在Milli-Q水中浸泡5-6小时，在液氮中研磨成粉末；

②转移至50ml离心管中，加入10ml提取缓冲液，其组成为50mM Tris，100mM NaCl，150mM EDTA，1％SDS，0.30mg/ml蛋白酶K，0.1％巯基乙醇，pH 8.0，65℃消化3h；

③缓慢加入3ml 6mol/L NaCl，盐析除去多余的蛋白及多糖，4℃10000rpm离心10分钟，收集上清液；

④加入等体积比例为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇，15000rpm离心10分钟，收集上清液；

⑤加入预冷的0.6倍体积的异戊醇，-20℃沉淀1-2h，室温放置15min后，15000rpm离心3分钟，去上清，收集DNA沉淀，用浓度为70％乙醇洗涤沉淀，在超净台放置5-10分钟吹晾干，溶于200ul TE缓冲液中。

步骤(2)所述的PCR，即聚合酶链式反应包括下列步骤：

①聚合酶链式反应的体系为25μl，各种试剂的用量分别为：

10×PCR缓冲液      2.5μl

MgCl₂ 25mM         1.6μl

dNTP 2.5mM         2.0μl

COIf 15μM         1μl

COIr 15μM         1μl

Taq酶5U/μl        0.125μl

上部提取的DNA      1μl

PCR级水            15.775μl

②聚合酶链式酶反应在PCR仪上进行，反应条件为：

94℃预变性5分钟，然后按以下条件反应35个循环反应：