[发明专利]一种迟缓爱德华氏菌DNA疫苗及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌DNA疫苗及其构建和应用。

背景技术

迟缓爱德华氏菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染人、动物和鱼类，后者包括鲤鱼、罗非鱼、大菱鲆、牙鲆和鳗鱼等具重要经济价值的养殖品种。由迟缓爱德华氏菌感染所造成的爱德华氏菌病每年给世界(包括我国)水产养殖业造成巨大的经济损失，因而，迟缓爱德华氏菌已被公认为一种危害严重的水产养殖病原菌。

目前世界上尚未有商业化迟缓爱德华氏菌疫苗。在实验室范围内检测有效的迟缓爱德华氏菌疫苗有灭活全菌疫苗和重组亚单位疫苗。灭活疫苗的优点是安全，但其缺点是免疫效果较差。重组亚单位疫苗由于制备过程中涉及蛋白质提取纯化等步骤而造价昂贵。相对而言，DNA疫苗具有灭活疫苗和重组亚单位疫苗的优点而无其缺点。DNA疫苗是一种在重组亚单位疫苗后兴起的疫苗，其原理是将疫苗抗原基因克隆于一真核表达载体中，随后将重组载体导入所要免疫的动物体内。疫苗抗原在机体细胞内表达合成，刺激机体的免疫系统，从而达到免疫保护目的。在水产养殖中，DNA疫苗大都是针对病毒性病原，针对细菌的DNA疫苗很少。迟缓爱德华氏菌DNA疫苗迄今尚未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌DNA疫苗及其构建和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

迟缓爱德华氏菌DNA疫苗：所述疫苗序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

迟缓爱德华氏菌DNA疫苗的构建：

1)质粒pPC2的构建：将质粒pCI-neo用XhoI/SmaI酶切，回收5.4kb片段，与寡聚核苷酸片段L86连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，而后在含安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为质粒pPC2；所述寡聚核苷酸片段L86为5’-TCGAGATATCGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCC-3’；

2)质粒pCFC的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物F8(5’-AGTACTGCCACCATGGCACAAGTAATCAACACCA  -3’)和R6(5’-CCCGGGACGCAGCAGAGACAGGA-3’)PCR扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α而后在含有100ug/ml Ap、40ug/mlXga1(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养，筛选出白色转化子，得质粒pBSFC；所得质粒pBSFC用ScaI/SmaI酶切，回收1.2kb片段；将步骤1)的质粒pCN2用EcoRV酶切后回收5.4kb片段；将步骤1)的质粒pCN2酶切回收片段与质粒pBSFC酶切回收片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含安卡青霉素的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为pCFC；

3)质粒pFXV6的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物F5(5’-GGCTCGGCGGATCT-3’)和R8(5’-ATGGACGCGCAGATCAAA-3’)PCR扩增，将PCR产物纯化；将步骤2)质粒pCFC用Sma I酶切，回收6.6kb片段，将回收片段与纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml Ap的LB固体培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为序列表1SEQ ID No.1中的碱基序列所示的迟缓爱德华氏菌DNA疫苗。

迟缓爱德华氏菌DNA疫苗的应用：将上述所得的迟缓爱德华氏菌DNA疫苗质粒转化到大肠杆菌后在LB培养基培养后用无内毒素质粒提取试剂盒提取，提取序列表1SEQ ID No.1中的碱基序列所示的迟缓爱德华氏菌DNA疫苗溶于PBS至浓度为200ug/ml，所得DNA疫苗悬液为对迟缓爱德华氏菌有免疫保护的作用。将上述DNA疫苗悬液以100ul的剂量对鱼类进行肌肉注射。

本发明具有如下优点：

1.本发明利用基因工程手段构建了一种迟缓爱德华氏菌DNA疫苗，并证明其具有相对高效的免疫保护性。

2.高保护率。本发明的DNA疫苗对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率达74％。

3.安全。本发明的疫苗没有任何毒性。

4.省时省力，只需一次免疫。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。